Metabolic oligosaccharide engineering applied to neural stem cells

• Author(s): Rodrigues, Inês Alexandra Figueiredo
• Date: 2012
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/7989
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Química; Teses de mestrado - 2012
• Document Type: Master Thesis
• Language: English
• Advisor(s): Fernández-Mayoralas Alvarez, Alfonso; Santos, Isabel Rego dos, 1948-

Description

Tese de mestrado em Química (Química, Saúde e Nutrição), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012 Metabolic oligosaccharide engineering (MOE) permits the introduction of subtle modifications into monosaccharides residues within cellular glycans. The first landmark in the development of this technique started in its application for the study of sialic acid biology. This sugar has a rather privileged role in vertebrate biology as it is often at the capping position of cell surface glycans and is therefore exposed for interactions with exogenous cells and proteins. MOE has now been applied to a myriad of problems in glycobiology, namely to disrupt glycan biosynthesis, chemically modify cell surfaces, probe metabolic flux inside cells and for proteomics analysis of cells. In this work the synthesis of three non-natural ManNAc analogues, ManNAz, ManNLev and ManNSH is described. It is also reported the enzymatic conversion of these ManNAc analogues into the respective sialic acid derivatives by the sialic acid aldolase. The enzymatic reaction rates obtained with ManNAz, ManNLev and ManNSH were 0.00130, 0.00080 and 0.00075 μmol/min, respectively. Amongst all the ManNAc analogues, ManNAz was found as the best candidate for MOE. The results obtained, which are on the same scale (0.0027μmol/min) as those obtained for the natural substrate (ManNAc) of the enzyme, are very positive. It is also described the peracetylation of the ManNAc analogues, for further manipulation. Ac4ManNAz was further used to perform several reactions with the purpose of labelling this compound with fluorine. In the future, other strategies will be applied to the other peracetylated derivatives (Ac4ManNLev and Ac4ManSAc), namely fluorescent labelling. A engenharia metabólica de oligossacáridos (MOE) permite a modificação subtil dos resíduos de monossacáridos que constituem as glicanas presentes na membrana celular. A primeira referência no desenvolvimento desta técnica começou com a sua aplicação no estudo da biologia do ácido siálico. Este açúcar representa um importante papel na biologia dos vertebrados, uma vez que se encontra na posição terminal das glicanas da superfície da célula, estando exposto a interacções com células e proteínas exógenas. Actualmente, MOE é aplicado a diferentes problemas da glicobiologia, tal como bloquear a biossíntese de glicanas, modificar quimicamente a superfície das células, servir de sonda para o fluxo metabólico no interior da célula e fazer a análise proteómica de células. Uma série de três análogos de ManNAc (ManNaz, ManNLev e ManNSH) foram sintetizados e utilizados na reacção com a enzima ácido siálico aldolase, a fim de saber qual é o melhor candidato para ser aplicado em MOE. A velocidade de reacção obtida para estes análogos de ManNAc foram 0,00130, 0,00080 e 0,00075 mol/min para ManNAz, ManNLev e ManNSH, respectivamente, revelando que o melhor candidato para usar em MOE é ManNAz. Além disso, os resultados obtidos são muito positivos, uma vez que são da mesma ordem de grandeza (0,0027μmol/min) que o obtido para o substrato natural da enzima (ManNAc). Os três análogos de ManNAc foram acetilados, e utilizou-se o derivado Ac4ManNAz para realizar várias reacções com o propósito de derivatizar este composto com flúor. No futuro, outras estratégias serão aplicadas aos outros derivados peracetilados (Ac4ManNLev e Ac4ManSAc), nomeadamente a derivatização com uma sonda fluorescente.