Author(s):
Cereja, Rui Filipe Vieira, 1989- 
Date: 2012
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/7664
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Poluição; Contaminação; Detritos; Cefalópodes; Bioquímica; Estuário do Sado - Portugal; Teses de mestrado - 2012
Description
Tese de mestrado. Biologia (Ecologia marinha). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012 O aumento exponencial da população mundial e o desenvolvimento industrial têm vindo a provocar um aumento das descargas de poluentes e degradação do meio aquático. Os estuários e as zonas costeiras são os principais locais de descargas e de retenção de poluentes, nomeadamente metais (Herut e Kress, 1997). Sendo considerados locais com elevada biodiversidade e importância ecológica, a protecção destas zonas tem, nos últimos anos, surgido como de extrema importância. Os efluentes domésticos e industriais, a contaminação pelo tráfego marinho e a poluição atmosférica são algumas da fontes antropogénicas de metais (Bryan et al., 1971). Os níveis de metais no meio podem aumentar também devido à erosão, aos detritos dos organismos e aos produtos de decomposição da matéria orgânica (Niencheski et al., 1994). Alguns metais, por exemplo o Fe, o Cu e o Zn, em concentrações naturais têm funções essenciais e são indispensáveis para a realização de funções metabólicas dos organismos, como parte integrante de enzimas, regulação de ADN e fluídos sanguíneos (Bryan, 1971; Joyce and Steitz, 1994; Ferraro, 2004). Outros metais não possuem funções metabólicas conhecidas, por exemplo o Cd e o Pb (Bustamante, 1998). A exposição dos organismos a elevadas concentrações de metais pode provocar efeitos nocivos ao nível bioquímico ou celular (Depledge et al., 1995; Goksyr et al., 1996), causando danos de formas muito variadas, como por exemplo danos ao nível do ADN, inactivação ou estimulação de actividade enzimática e produção de radicais livres de oxigénio (Lindquist and Crayg., 1988; Ushmar and Halliwell, 1996; Raimundo et al., 2010; Pereira et al., 2010).Radicais livres de oxigénio são radicais resultantes de moléculas de oxigénio como o radical superoxido (O2-*), radical hidroxila (OH-*), radical peroxilo (RO2*), acilo radical (RO*), radical hidroperoxila (HO-2*) e peroxido de hidrogénio (H2O2) e ácido hipocloroso (HOCl) (Halliwell and Gutterridge, 1999). Muitas destas moléculas são produzidas durante o normal metabolismo das células, havendo mecanismos de defesa que previnem que estas causem danos nos componentes celulares. Os metais (assim como vários outros factores de stresse) aumentam a quantidade destes radicais ao alterarem o metabolismo por indução de stresse. Para além disso, alguns metais também criam radicais directamente através das reacções de Feton e diminuem a quantidade de enzimas antioxidades por inibição das mesmas. Todos estes efeitos vão alterar o equilíbrio entre enzimas antioxidantes e os radicais de oxigénio levando a que estes comecem a reagir com outras moléculas presentes como proteínas, lípidos e ADN causando danos nestes (Winston and Di Giulio, 1991; Singh et al., 2004). Ao reagirem com os radicais, os lípidos passam a peróxidos lipídicos (LPO) como hidroperoxidos lipídicos (lipid-ooh) que por sua vez formam radicais hidroperoxila (ROO*•) e acilo (RO*•) que por sua vez reagem com os lípidos vizinhos propagando a oxidação em cadeia (Ushmar and Halliwell, 1996). Esta oxidação cria vários problemas na célula, desde oxidação de proteínas, perda de Ca2+, perda de fluidez da membrana e colapso da membrana levando à morte da célula (Ushmar and Halliwell, 1996; Storey, 1996). As “Heat Shock Proteins” (HSP) são proteínas essências para o normal funcionamento da célula actuando como chaperonas permitindo a normal enrolamento (“folding”) das proteínas (Fink, 1999) e são o sistema mais semelhante em todos os grupos de seres vivos, sendo comum entre arquias, bactérias, plantas e animais (Lindquist and Craig, 1988). Estas proteínas são conhecidas como proteínas de stresse, pois a sua expressão é principalmente associada a diversos eventos, respondendo a temperatura (função pela qual foram nomeadas HSP), stress oxidativo, metais, campos magnéticos e etanol, sendo que todos estes factores causam danos na estrutura terciária das proteínas. A sua função durante eventos de stresse é evitar o enrolamento errado de proteínas, e caso já tenha ocorrido corrigi-lo ou eliminar proteínas que tenham perdido a sua função (Parsell and Lindquist, 1993). As famílias de HSP que são normalmente associadas à resposta a stresse causado por metais, são as famílias HSP60 e HSP70. As proteínas “Heat Shock Congnate 70KDa” (HSC70), são proteínas traduzidas de forma constitutiva que estão encarregues da normal agregação das novas proteínas formadas no retículo endoplasmático e as que vão ser transferidas para as mitocôndrias (Turner et al., 1999). Quando em stresse as células aumentam a produção destas proteínas acumulando-as nos agregados de proteínas com o objectivo de promover o correcto enrolamento, ou corrigir ou eliminar o enrolamento mas efectuados (Dastoor and Dreyer, 2000). Os cefalópodes são exclusivamente marinhos, com uma elevada distribuição, encontrando-se desde a superfície do oceano até às zonas abissais. O choco comum, Sepia officinalis, vive em alto mar durante o inverno vindo depois para as zonas costeiras e estuários para se reproduzir. Nestas zonas, as fêmeas depositam os ovos em substrato duro como troncos de árvores, algas e artes de pesca, ficando estes ovos expostos à poluição destas zonas (Boucaud-Camou and Boismery, 1991). De forma a impedir a entrada de contaminantes provenientes da água a membrana glico-lipo-proteica dos ovos possui uma camada glicoproteica que, com o avançar do desenvolvimento e o crescimento do embrião, começa a tornar-se mais fina permitindo a passagem de alguns contaminantes e a acumulação no embrião (Bustamante et al., 2004; Lacoue-Labarthe et al., 2008, 2010). Vários estudos foram realizados analisando a variação de concentrações de metais durante a embriogénese mas quase todos em condições laboratoriais controladas sendo importante explorar o comportamento desta variação em meios naturais. O objectivo deste trabalho foi estudar a partição de metais na membrana glico-lipo-proteica e embrião de choco ao longo da ontogenia expostos a diferentes níveis de contaminação ambiental. Foram selecionadas três áreas de estudo no Estuário do Sado com conhecidas diferenças na contaminação (Caeiro et al., 2005). Foi também estudado o stresse induzido nos embriões devido ao aumento dos teores de metais através da análise da concentração de enzimas de antioxidantes (CAT, SOD e GST), “Heat Shock Proteins” e peroxidação lipídica. O estuário do Sado junta áreas altamente urbanizadas e industrializadas com áreas de reservas naturais e quase pristinas, sendo um bom sistema para comparar as respostas em áreas pristinas com áreas contaminadas (Catarino et al., 1987). Segundo Caeiro et al. (2005) podemos encontrar vários níveis de contaminação ao longo do Estuário do Sado. Desses locais usou-se três diferentes locais sendo por ordem crescente de contaminação: Caldeira (pristino), Eurominas (contaminação intermédia) e Setnave (muito contaminado). Para analisar a evolução da acumulação dos metais ao longo da embriogénese os embriões foram separados em três diferentes estados sendo o estado 1 (S1) equivalente aos estados I-VI o estado 2 (S2) aos estados XI-XV e o estado 3 do estado XIX (estados retirados de Naef’s, 1928). Os embriões foram colhidos à mão sendo de imediato separada a membrana glico-lipo-proteica do embrião deixando apenas o embrião, há excepção de estado 1 onde foi deixada também a membrana vitelina, pois caso contrário estes embriões tornar-se-iam de difícil manuseio. Assim que separadas, ambas as partes foram congeladas a -80º C. De seguida, as amostras foram liofilizadas e homogeneizadas e submetidas a uma digestão ácida a várias temperaturas de acordo com Ferreira et al. (1990). Posteriormente foram determinados os níveis de V, Cr, Mn, Ni, Co, Cu, Zn, As, Se, Mo, Cd e Pb na membrana glico-lipo-proteica e no embrião por Espectrometria de Massa com Plasma Induzido Acoplado (ICP-MS). Para quantificar a concentração das proteinas antioxidantes, HSP e peroxidação lipídica as amostras foram homogeneizadas em tampão de homogeneização e congeladas a -20º C. As concentrações de superóxido dismutase, catálase e Glutationa S-Transferase (GST) foram medidas através do protocolo descrito em Correia et al. (2003), a peroxidação lipídica pelo protocolo descrito em Diniz et al. (dados não publicados) e as HSP70/HSC70 através do protocolo adaptado por Njemini et al. (2005). Depois de testados os prossupostos de normalidade e homocedasticidade foi escolhido o teste estatístico não paramétrico Kurskal-Wallis. De um modo geral, os elementos analisados apresentaram níveis detectáveis na membrana glico-lipo-proteica e no embrião. O Zn foi o elemento que registou os teores mais elevados seguido do As e do Cu. Os três elementos são considerados essenciais para o desenvolvimento do ovo, sugerindo uma regulação metabólica pelo mesmo. No entanto, comparando as duas matrizes, a membrana apresentou as concentrações mais elevadas comparativamente ao embrião. Este resultado sugere que esta membrana consegue proteger eficazmente o embrião, formando uma barreira para a entrada de elementos vindos do ambiente. Contudo, com o crescimento do ovo a membrana glico-lipo-proteica vai ficando mais fina permitindo uma entrada de contaminantes. Este efeito foi mais evidente no estado mais avançado de desenvolvimento, S3, na área mais poluída, Setnave. Associado ao crescimento do ovo, era também esperado um efeito de diluição nas concentrações dos elementos metais, mas tal efeito só pode ser visto para as concentrações de As, sugerindo assim uma maior importância da entrada de elementos via ambiente que do efeito de diluição. Nos ovos retirados da fêmea, observou-se uma elevada concentração de metais, principalmente de elementos essenciais. Este padrão sugere um importante efeito de transferência parental. Esta transferência por parte dos progenitores pode explicar grande parte da contaminação encontrada por exemplo na Caldeira (local menos contaminado). Com a subida da concentração dos vários elementos era expectável um aumento de stresse oxidativo e danos no embrião. De acordo com os dados recolhidos nesta experiência nenhum destes cenários se verificou não havendo em geral qualquer alteração significativa. Por outro lado, parece haver um outro factor de stresse com maior importância que os elementos analisados, para estas condições ambientais, que não tenha sido controlado neste estudo. Não tendo sido controlado este fator, as variações encontradas nas enzimas antioxidantes, HSP e MDA neste estudo são aparentemente naturais. Uma prova de tal factor é a variação da GST que, embora sem diferenças significativas, apresentou um padrão de variação, aumentando sempre do S1 para o S2 e tendo uma pequena redução para o S3. A mesma variação foi verificada nas concentrações de SOD e MDA mas menos evidentes, podendo ser apenas consequência da variabilidade natural da amostra e não resultantes de um factor de stresse. A variação destes biomarcadores com a contaminação ambiental que deverá ser analisado em estudos futuros. The coastal and estuarine areas are impacted systems due to their proximity to populated and industrial areas. Estuaries receive contamination via river in addition to the direct input and are considered especially sensitive. These activities increase the concentrations of elements that otherwise would be in harmless to life. The present work aims to search the influence of environmental contamination in the eggshell and embryos of cuttlefishes during the embryonic development. To achieve this objective eggs were captured in areas with different contamination levels and separate into eggshell and embryo in three/four embryonic stages. Moreover, stress induced by contaminants in the embryo was evaluated by measuring antioxidant enzymes, such as lipid peroxide and heat shock proteins 70Kda/heat shock cognate 70Kda (HSP70/HSC70) concentrations. The eggs presented high values of essential elements even in the ones taken from the female. Almost all elements were able to accumulate in the eggshell during embryonic development and in much lower levels in the embryo. These results suggested that the eggshell is a good protective shield against waterborne metals. The antioxidant enzymes have shown no relation to trace elements in the studied environment concentrations, having no significant differences for any capture area. On other hand, a pattern of GST variation was seen (although 7 without significant differences) with increasing concentrations from S1 to S2 and a small decrease to S3. The same pattern was verified in SOD and MDA concentrations but not so evident, suggesting a biological variation and not as result of environmental influence.
