Author(s):
Ramos, Ana Patrícia Parracho Filipe, 1988- 
Date: 2012
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/7580
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Neurobiologia; Biologia do desenvolvimento; Retina; Neurogénese; Teses de mestrado - 2012
Description
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012 A retina, como parte do sistema nervoso central, é formada a partir do tubo neural. O neuroepitélio que dá origem à retina, apresenta muitas similaridades com o neuroepitélio que origina o cérebro. Desta forma, o estudo da neurogenese na retina tem permitido a compreensão dos processos envolvidos durante o desenvolvimento do restante sistema nervoso central. O neuroepitélio é constituído por apenas uma camada de células neuroepiteliais. Estas estão ligadas à superfície apical e, no extremo oposto, à superfície basal. Por sua vez, o núcleo destas células, migra ao longo de todo o eixo apical-basal, de uma forma que está dependente do ciclo celular. A esta migração nuclear deu-se o nome de migração inter nuclear (Interkinetic nuclear migration ou IKNM). O facto de os núcleos migrarem dentro das células e adquirirem diferentes posições ao longo do tempo, faz com que o neuroepitélio adquira uma estrutura pseudoestratificada. A característica mais particular da IKNM é o facto de as células dividirem-se apenas quando o núcleo se encontra junto da superfície apical. Para tal, este migra activamente em direcção à superfície apical durante a fase G2 do ciclo celular. A retina é composta por cinco tipos de neurónios, três dos quais são excitatórios - foto-receptores, células bipolares e células ganglionares – e dois tipos de interneurónios – células amácrinas e células horizontais. Estes neurónios estão distribuídos por três camadas nucleares distintas. Os foto-receptores constituem a camada mais externa (outer nuclear layer ou ONL) , junto à superfície apical; enquanto que células horizontais, bipolar e amácrinas distribuem-se pela camada interna (inner nuclear layer ou INL). Células ganglionares compõem a camada ganglionar (ganglion cell layer ou GCL), a camada mais basal da retina. Todas os neurónios na retina provêm do mesmo grupo de células neuroepiteliais. Estas células estão sujeitas a IKNM e por isso dividem-se exclusivamente na superficie apical. Até há pouco tempo pensava-se que todos os neurónios eram formados na superfície apical após a divisão de uma célula neuroepithelial. Esta divisão seria procedida pela migração da célula pós-mitótica para a camada final onde se iria diferenciar. No entanto, foi descoberto que em peixe-zebra (Danio rerio) a camada de células horizontais é totalmente formada a partir da divisão de progenitors em posições não apicais, no local onde a futura camada destas células se vai formar. Para além das células horizontais, trabalhos recentes no nosso laboratório conduziram à descoberta de que a camada de células bipolares também é formada parcialmente pela divisão de progenitores não apicais. Tanto os progenitores que dão origem às células horizontais como aqueles que originam as células bipolares são unipotentes e expressam marcadores específicos da linhagem que vão originar. Progenitores não apicais das células horizontais expressam o factor de transcrição Ptf1a e o marcador celular Cx55.5; progenitores não apicais das células bipolares expressam o factor de transcrição Vsx1. A retina do peixe-zebra desenvolve-se num curto espaço de tempo e às 72 horas após a fertilização (hpf) a neurogenese está praticamente completa. Por isso mesmo, os progenitores têm de proliferar e formar neurónios rapidamente. Além disso, a diferenciação dos diferentes tipos de neurónios ocorre em períodos de tempo que se sobrepõem, isto leva a que numa determinada janela temporal, várias camadas de células estejam a ser formadas ao mesmo tempo. A junção destes factores pode levar ao aparecimento de constrangimentos dentro do tecido podendo influenciar a proliferação celular, neurogeneses e migração. Foi com base nestes pressupostos que neste trabalho quisemos perceber se as características do tecido poderiam ter influência no aparecimento dos progenitores não apicais. Os resultados previamente obtidos no laboratório apontavam para o facto de que os primeiros progenitores não apicais das células bipolares, surgirem ao mesmo tempo que o desenvolvimento da camada de células foto-receptoras Esta camada de células localiza-se justaposta à superfície apical, o que poderá limitar o seu acesso por parte dos progenitores. Tentou-se então perceber se o desenvolvimento da camada de células foto-receptoras poderia estar na base do surgimento dos progenitores de células bipolares não apicais. Para tal pretendeu-se eliminar a camada de células foto-receptoras e verificar se o numero deste tipo de progenitores poderia ser alterado. Para além de limitações no acesso à superfície apical, outros factores dentro do tecido podem influenciar o surgimento de progenitores não apicais. Aquando da ablação genética de determinados tipos de células, a retina mantém a sua estrutura e compensa as células perdidas produzindo um maior número de células de outro tipo. Por exemplo, quando as células ganglionares são eliminadas, estas são substituídas por células que expressam Ptf1a, um factor de transcrição essencial para a diferenciação dos progenitores em células horizontais e amacrinas. Por outro lado, quando células horizontais e amácrinas são eliminadas, a INL é totalmente ocupada por células bipolares que são produzidas em maior número. Com este projecto tentou-se perceber onde é que este número supérfluo de células era originado (se na superfície apical ou noutro local da retina). Para tal, as células ganglionares e interneurónios foram eliminadas recorrendo a dois morfolinos que inibem a expressão dos factores de transcrição essenciais para a produção destes dois tipos celulares: Ath5 (essencial para o desenvolvimento de células ganglionares) e Ptf1a (essencial para o desenvolvimento de interneurónios). Para percebermos onde é que as células se dividiam, as retinas dos embriões onde estes neurónios foram eliminados, foram marcadas com um anticorpo especifico para células que estão na fase mitótica e analisados em diversos estadios do desenvolvimento. A análise dos embriões trouxe resultados surpreendentes. Aquando da eliminação das células ganglionares, vários conjuntos de células foram observados a dividirem-se perto da superfície basal. Algumas destas divisões ocorrem após o estabelecimento da GCL, isto é, após a grande parte dos neurónios desta camada já estarar diferenciada e com sinapses estabelecidas. Divisões celulares em posições tão basais nunca foram descritas antes. Na análise dos embriões onde os interneurónios foram eliminados, observou-se que a frequência de progenitores não apicais que expressam Vsx1 diminuiu. Este facto é bastante intrigante uma vez que são as células positivas para Vsx1 que originam a maior parte das células bipolares. No entanto observou-se também que existe um aumento no número de progenitores não apicais que não expressam Vsx1. Estes resultados para além de intrigantes deixam muitas questões em aberto. No caso em que as células ganglionares são eliminadas, ficamos por descobrir porque é que estas células se dividem tão basalmente. Específicamente será importante perceber se se tratam de células diferenciadas ou de progenitores indiferenciados. Depois será também preciso clarificar o porquê destas células se dividirem nesta região. Tendo em conta que a GCL está a ser preenchida por um tipo de células que normalmente não a compõem é indicativo que a ausência desta camada tem influência no comportamento das células. Na situação em que as células horizontais e amácrinas foram eliminadas também será importante saber o que vão originar os progenitores não apicais observados, que não expressam Vsx1. Os resultados aqui apresentados apontam para a existência de factores externos, nomeadamente factores ligados à estrutura celular do tecido que influenciam o aparecimento de progenitores não apicais. Uma futura exploração mais detalhada destas observações irá tornar possível o esclarecimento de como é que a estrutura e morfologia de um tecido poderão influenciar a proliferação celular. Until recently it was thought that all the neurons in the retina were formed by the division of multipotent progenitors at the apical surface, followed by migration of the post-mitotic cell to the prospective neuronal layer. However, it was recently shown that, in the zebrafish (Danio rerio) retina the layer of horizontal cells (HCs) is formed solely by committed precursors that divide in non-apical positions. This finding was further expanded to the formation of the bipolar cell (BC) layer, by the discovery that BCs precursors can also divide at non-apical positions. Both pools of non-apical precursors are unipotent and express markers of the cell lineage that they will give rise to: Ptf1a and Cx55.5 in the case of HC precursors; Vsx1 in the case of BCs precursors. The rapid proliferation and neurogenesis upon the development of the zebrafish retina might lead to the emergence of tissue constraints, specifically space constraints. In this work we set out to understand the occurrence of non-apical progenitors in the retina taking tissue architecture into account. Upon elimination of the most basal layer in the retina (the ganglion cell layer) we found that subset of cell can divide in regions close to the basal lamina. Divisions at such basal positions were never described. Furthermore we found that, upon ablation of the interneurons, a pool of non-apical cells, negative for the expression of Vsx1 emerges. The results shown in these works point towards the existence of external factors, like the cellular structure of the tissue, that play a role in the emergence of non-apical progenitors. A further exploration of these observations will allow understanding how the structure and morphology of the tissue can influence cellular proliferation.
