Author(s):
Mouro, Francisco Melo Albuquerque Saraiva, 1988- 
Date: 2012
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/7431
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Neurobiologia; Adenosina; Hipocampo; Teses de mestrado - 2012
Description
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012 O hipocampo é a estrutura cerebral mais estudada na investigação neurocientífica. A subdivisão CA1 do hipocampo contém a população neuronal que apresenta menor heterogeneidade entre neurónios, encontrando-se organizada em camadas bem definidas, o que torna os neurónios fáceis de identificar e de estudar (Szilágyi et al. 2011). O neurónio é a unidade sinalizadora individual do sistema nervoso central (SNC). Os neurónios estão inseridos numa complexa rede de circuitos neuronais que se encontra distribuída por todo o cérebro, comunicando entre si através de sinais eléctricos designados como potenciais de acção e potenciais sinápticos (Adrian, 1957). A transmissão de informação entre um neurónio localizado pré-sinapticamente e uma célula pós-sináptica designa-se como transmissão sináptica (Breathnach, 2005). As sinapses químicas envolvem a libertação pré sináptica de neurotransmissores para a fenda sináptica (Connors & Long, 2004), activando receptores específicos localizados na membrana da célula pós-sináptica (Schoepp et al. 1999). Os receptores NMDA (N-methyl-D-aspartate) são receptores ionotrópicos cujo principal agonista endógeno é o glutamato (Bakkar et al. 2011. As suas principais características são a dependência de voltagem, elevada permeabilidade ao cálcio e cinética de activação/desactivação lenta (Doherty & Sladek, 2011). Os receptores NMDA são moléculas heteroméricas formadas pelas subunidades GluN1, GluN2 e GluN3 (Groc et al. 2009). Na região CA1 do hipocampo, são tetra heteromeros compostos por duas subunidades GluN1 e duas subunidades GluN2 (Bakkar et al. 2011), podendo classificar-se como sinápticos ou extrasinápticos (Groc et al. 2009). A actividade dos receptores NMDA está associada, de forma paradoxal, a fenómenos indutores de sobrevivência neuronal e de plasticidade sináptica (Larkman & Jack, 1995; Lipton & Nakanishi, 1999), e a episódios neurodegenerativos associados a morte neuronal (Xu et al. 2009). A ambivalência nas consequências da actividade dos receptores NMDA recebe o nome de “paradoxo dos receptores NMDA” (Hardingham & Bading, 2010), sendo atribuída à localização sináptica destes receptores. De facto, a actividade de receptores NMDA sinápticos aparenta estar associada a fenómenos de protecção neuronal, ao passo que a actividade de receptores NMDA extrasinápticos conduz a fenómenos de apoptose neuronal (Hardingham & Bading, 2010; Stark & Bazan, 2011). A actividade de receptores NMDA pode ser influenciada pela acção de neuromoduladores do SNC. A neuromodulação consiste na habilidade neuronal para modificar as propriedades eléctricas dos neurónios em resposta a mudanças bioquímicas intracelulares resultantes de estímulos sinápticos ou hormonais, permitindo ao SNC adaptar a sua capacidade de controlar funções fisiológicas num ambiente em constante mudança (Kaczmarek & Levitan, 1987). A adenosina é um neuromodulador que medeia os seus efeitos biológicos através de quatros subtipos de receptores: receptores A1, A2A, A2B e A3 (A1Rs, A2ARs, A2BRs eA3Rs) (Tsutsui et al 2004). Grande parte das acções neuromoduladoras da adenosina são mediadas pelos receptores A1 e A2A (Gomes et al. 2010). Os receptores A1 ligam-se a proteínas Gi, cuja actividade inibe a actividade da adenilato ciclase (van Calker et al. 1979). Por seu turno, os receptores A2A ligam-se a proteínas Gs, que estimulam a expressão de adenilato ciclase (Corvol et al. 2001). Enquanto os receptores A1 se encontram amplamente disseminado pelo cérebro (Dunwiddie & Masino, 2001), os receptores A2A estão distribuídos em áreas especificas como o estriado (Haas & Selbach, 2000), embora estejam também presentes em outras áreas cerebrais (Fredholm et al. 2005). A adenosina é uma substância neuromoduladora capaz de inibir ou de estimular a neurotransmissão no SNC (Fredholm & Dunwiddie, 1988). Os receptores A1 reduzem a libertação de neurotransmissor e inibem a transmissão sináptica. As acções inibitórias mais proeminentes dos receptores A1 estão identificadas em sistemas de transmissão glutamatérgica excitatória, através da inibição na libertação do neurotransmissor glutamato (Barrie & Nicholls, 1993). Apesar da actividade dos receptores A2 ter um impacto limitado no controlo da transmissão sináptica basal, eles são cruciais no controlo da plasticidade sináptica (Gomes et al. 2010). No hipocampo, a utilização de agonistas (Cunha et al. 1996) e antagonistas (Li & Henry, 1998) específicos para estes receptores provocam, respectivamente, aumentos e reduções na transmissão sináptica excitatória. A nível pré-sináptico, os receptores A2A desempenham um papel facilitatório na libertação de glutamato (Lopes et al. 1999). No hipocampo, os efeitos moduladores dos receptores A2A sobre a actividade dos receptores NMDA é menos bem conhecida. Noutras estruturas cerebrais há evidências de que, a nível pós-sináptico, os receptores A2A modulam a actividade dos receptores NMDA (Wirkner et al. 2004; Tebano et al. 2005; Rebola et al. 2008). De igual forma, sabe-se que em neurónios CA1 piramidais, os receptores A2A de adenosina controlam de forma directa a activação de receptores AMPA de glutamato (Dias et al. 2002). Este trabalho foi desenvolvido com o objectivo de compreender se a activação farmacológica de receptores A2A de adenosina pode modular a actividade de receptores NMDA na região CA1 do hipocampo. Utilizando fatias de hipocampo obtidas a partir de ratos Wistar jovem-adultos, os dados foram adquiridos através de técnicas de electrofisiologia, nomeadamente, procedimentos de patch-clamp utilizando a configuração whole-cell. Primeiramente, foi necessário garantir que as correntes evocadas refletiam exclusivamente actividade de receptores NMDA. Assim sendo, foi utilizado CNQX (10μM), um antagonista competitivo selectivo para receptores de glutamato AMPA e kainato. Os resultados não demonstram alterações significativas nas correntes (99%±2.9% n=3, p>0.05), o que permite concluir que as correntes registadas estavam apenas a ser evocadas pela actividade dos receptores NMDA. De igual forma, para garantir que este efeito está dependente da activação de receptores NMDA, foi utilizado um antagonista especifico destes receptores. A aplicação de DL-APV (50μM) provocou um decréscimo muito significativo nas correntes registadas (76%±4.9% n=3, p<0.005). De seguida, com o objectivo de tentar encontrar um efeito modulador dos receptores A2A sobre a actividade dos receptores NMDA, começou-se por avaliar os efeitos do CGS 21680, um agonista selectivo dos receptores A2A, sobre a actividade dos receptores NMDA. A adição de CGS 21680 (30nM) provocou um aumento significativo nas correntes mediadas pela actividade dos receptores NMDA (23%±4,7% n=6, p<0.005). Estes dados apontam para um efeito modulador dos receptores A2A que potencia a actividade dos receptores NMDA em células CA1 do hipocampo. Para assegurar que este efeito reflecte um efeito modulador dos receptores A2A, foi adicionado o agonista CGS 21680 na presença prévia do antagonista selectivo dos receptores A2A, o SCH 58261. A adição de SCH 58261 (100nM) não causou diferenças significativas na amplitude das correntes (3%±14,5% n=3, p>0.05), o que significa que os receptores A2A endógenos não contribuem para o efeito anteriormente registado. A adição subsequente do agonista CGS 21680 (30nM), após a adição prévia do antagonista durante 10 minutos, não provocou alterações significativas na amplitude das correntes registadas (2%±9,0% n=5, p>0.05). O facto do efeito potenciador do agonista ser prevenido pela presença do antagonista dos receptores A2A, permite concluir que este efeito modulador é mediado por receptores A2A. Estes resultados sugerem que os receptores A2A modulam a actividade dos receptores NMDA, resultando numa potenciação das correntes pós-sinápticas mediadas pelos receptores NMDA. Estes resultados reflectem um efeito ainda não descrito das capacidades neuromoduladoras dos receptores A2A. Futuramente, seria importante discriminar se as correntes mediadas reflectem a actividade de receptores NMDA localizados sinapticamente ou extrasinapticamente, uma vez que a actividade de receptores NMDA localizados em diferentes áreas sinápticas tem implicações diferentes para a saúde neuronal. A memantina, um fármaco que bloqueia preferencialmente a actividade de receptores NMDA extrasinápticos, poder-se-á revelar uma ferramenta útil para uma investigação futura sobre o tema. Hippocampal excitatory synaptic plasticity is often considered the synaptic basis for memory formation. NMDAR activity is deeply involved in long-lasting changes in synaptic plasticity. Adenosine modulatory actions upon excitatory glutamatergic transmission are well described. However, the modulatory actions of adenosine A2ARs upon NMDARs activity in CA1 pyramidal cells have never been reported. Thus, the effect of A2AR activation on NMDARs-mediated postsynaptic currents (PSCs) was examined in CA1 pyramidal neurons of young (3-10 weeks) rat hippocampal slices, by using the whole-cell patch-clamp technique (Vh = -60mV). NMDARs-mediated currents were evoked through pressure application of NMDA (150μM) (selective NMDAR agonist) directly onto the cell soma. Bath application of A2AR agonist CGS 21680 (30nM) induced significant increases on NMDA-evoked currents (23%±4,7% n=6, p<0.005). To further address if this effect was caused by an A2AR-mediated modulation of NMDA-evoked PSCs, CGS 21680 (30nM) was superfused in the presence of SCH 58261 (100nM), a selective A2AR antagonist, which was added to the perfusion 10 minutes before the agonist. NMDA-evoked PSCs were not significantly altered by the presence of CGS 21680 (30nM) when A2ARs were previously blocked by SCH 58261 (100nM) (2%±9,0% n=5, p>0.05). To assure that the measured currents were elicited by NMDARs activity, CNQX (10μM) was used to block the activity of AMPA/kainate receptors. The results show no significant changes in NMDA-evoked PSCs in the presence of CNQX (99%±2.9% n=3, p>0.05), suggesting that these currents were mediated by NMDARs. Finally, the use of DL-APV (50μM) - selective NMDARs antagonist - served to further assure that NMDARs mediated the observed currents. In the presence of DL-APV, NMDAevoked postsynaptic currents significantly decreased (76%±4.9% n=3, p<0.005). Together these results allow to conclude that A2ARs exert a modulatory effect over NMDARs activity at the CA1 neurons of the hippocampus, resulting in potentiation of NMDA-evoked PSCs.
