Author(s):
Repolho, Tiago Filipe Baptista da Rosa, 1974- 
Date: 2012
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/7396
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Paracentrotus lividus; Larvas; Crustáceos; Teses de doutoramento - 2012
Description
Tese de doutoramento, Biologia (Biologia Marinha e Aquacultura), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012 In the present study, we have evaluated 4‐arm exotrophic larvae of sea urchin Paracentrotus lividus (Echinodermata: Echinoidea) as live feed in marine decapod crustacean larviculture, in comparison to Artemia spp. naupliar stages, a commonly used live prey in marine hatcheries. We therefore investigated several key parameters to assess the potential of P. lividus plutei as live feed for crustacean larvae, namely: 1) broodstock diet manipulation in order to obtain both quantitative and qualitative year round production of 4‐arm echinoplutei, free from environmental and reproductive seasonal constraints; 2) best possible biotic conditions to perform sea urchin in vitro fertilization, namely sperm:egg ratios and egg concentrations, and its relation to early stage segmentation and larvae development; 3) mass production possibility in terms of larvae media culture conditions, plutei stocking densities and larvae feed and enrichment; and acceptability as live feed by predator larvae (Lysmata seticaudata, Palaemon elegans, Maja brachydactyla, Pachygrapsus marmoratus and Xantho incisus). Additionally, we studied the possibility to differentiate P. lividus broodstock sex by means of a spine external morphological characteristic. Under controlled laboratory conditions, percent egg fertilization above 99% and high values for percent normal development (≥85%) were obtained when captive breed P. lividus broodstock was fed an inert diet based upon maize and wheat flour mixture. Whole egg total amino acid composition was similar between P. lividus fed this inert diet and wild caught organisms. Enrichment potential in terms 4‐arm plutei fatty acid profile and lipid content was possible through manipulation of the lipid source chosen for captive P. lividus broodstock diet. Sperm:egg ratios were found to influence percent egg fertilization and segmentation development after 90 minutes post‐fertilization, but not plutei total length, post‐oral arm length and normal percent larvae development. Water renewal (every 2 days) during P. lividus larviculture was found to be an essential abiotic culture condition to sustain plutei development and survival until 18 days post‐fertilization. All plutei larval feeds (live microalgae, inert microdiets, single or mixed provided), supported P. lividus larvae growth and survival until 18 days post‐fertilization (DPF), with D. tertiolecta being found to be the most appropriate diet in terms of larvae development and survival outcome. When cultured at a initial stocking density of 40 plutei.ml‐1, inert microdiets were unable to sustain P. lividus plutei survival to 10 DPF. Plutei survival was found to be inversely correlated with increasing culture densities. Paracentrotus lividus plutei enrichment with Algamac 3050 flake, was found to cause mass mortality at 5 and 10 DPF. Paracentrotus lividus exotrophic 4‐arm plutei was ingested and preyed by 4 (Lysmata seticaudata, Maja brachydactyla, Pachygrapsus marmoratus and Xantho incisus) out of 5 crustacean larvae tested, but were unable to sustain complete larvae development and survival to settlement of L. seticaudata, M. brachydactyla and P. marmoratus species. No apparent advantage of P. lividus 4‐arm plutei as live feed for marine crustacean decapod larvae was found in comparison to Artemia spp.. Finally, the analysed spine morphological characteristic, as a tool for sex differentiation between P. lividus adults, does not allow accurate and feasible results. Os estudos efectuados e incluídos nesta tese de doutoramento, resultam da formulação de uma hipótese que se baseou em evidências cientificamente comprovadas e que pretendeu a avaliar a utilização de larvas exotróficas do equinoderme Paracentrotus lividus (Lamarck, 1816) (Echinodermata: Echinoidea) como presas vivas na larvicultura de crustáceos decápodes marinhos. No seguimento de evidências científicas baseadas em estudos ao nível de comunidades planctónicas marinhas, que demonstram a importância de estadios larvares de ouriços‐do‐mar na sua composição e biomassa, acrescido de resultados laboratoriais que comprovam a sua predação por estadios larvares de crustáceos marinhos, pretendeu‐se inferir o potencial de larvas exotróficas de P. lividus como presa vivas face a outras espécie zooplanctónica normalmente usada como alimento vivo (Artemia spp.). Neste contexto, efectuou‐se um conjunto de estudos experimentais com o objectivo de verificar a aplicabilidade da hipótese sugerida. Deste modo escolheu‐se esta espécie uma vez que se trata do ouriço‐do‐mar de maior abundância na zona rochosa intertidal e subtidal da costa Portuguesa. Em segundo lugar, informação cientifica disponível permite a manutenção desta espécie em cativeiro, com custos operacionais baixos. De igual modo sendo possível a manutenção anual de organismos adultos maturos em cativeiro, independentemente da época reprodutiva no meio natural, torna possível a obtenção em cativeiro de grandes quantidades de gâmetas e consequentemente de larvas. A escolha de estadios larvares exotróficos prendeu‐se por um lado com o facto da sua biometria ser semelhante a naúplios recém‐eclodidos e metanáuplios (24h) de Artemia spp., assim como à hipótese da sua qualidade nutricional poder ser melhorada por intermédio de alimentação exógena. Finalmente e dada a sua fraca capacidade natatória, estes estadios podem constituir uma presa com maior capacidade de captura por parte de potenciais predadores. De modo a avaliar a potencialidade destas larvas como presas vivas na larvicultura marinha, procedeu‐se a elaboração de um conjunto de trabalhos experimentais, com vista à verificação da hipótese apresentada. Em primeiro lugar foi analisado o efeito da alimentação (dietas naturais e artificiais) de adultos desta espécie em cativeiro ao nível do índice gonadossomático, conteúdo proteico de óvulos (aminoácidos), taxas de fertilização, biometria e desenvolvimento larvar normal. Foi efectuada uma comparação com ouriços‐do mar selvagens, recolhidos durante a época reprodutiva. Obtiveram‐se valores similares de desenvolvimento larvar normal entre organismos selvagens e adultos alimentados com uma das dietas inertes usadas. Como principal resultado ficou provada a possibilidade de obtenção de taxas de desenvolvimento larvar normal elevadas, quando adultos de P. lividus, mantidos em cativeiro, eram alimentados com uma dieta inerte apropriada, cuja fonte proteica é baseada numa mistura de farinha de milho e trigo. De seguida inferiu‐se a qualidade nutricional (conteúdo lipídico e composição em ácidos gordos) de óvulos e larvas endotróficas de P. lividus mantidos em cativeiro e alimentados com dietas naturais (grãos de milho, macrolgas e mistura) e inertes. Procedeuse posteriormente à manipulação lipídica de dietas inertes artificiais, pela incorporação de óleos ricos em ácidos gordos poliinsaturados. Como principal resultado, verificou‐se a incorporação de ácidos gordos poliinsaturados em óvulos e larvas endotróficas resultantes de adultos cuja alimentação tinha sido efectuada com dietas artificiais elaboradas com fontes lípidicas com uma maior proporção de lípidos insaturados. Posteriormente foram investigados quais os efeitos que diferentes racios de espermatozóides:óvulos e concentração de óvulos, aplicados na fertilização in vitro desta espécie, poderiam ter ao nível de taxas de fertilização, desenvolvimento embrionário, biometria e desenvolvimento larvar resultante. Pretendeu‐se deste modo inferir se existia alguma relação directa entre a hipótese formulada e os resultados obtidos, para os parâmetros analisados. Verificou‐se que com o aumento de rácios de espermatozóides:óvulos testados, ocorre um aumento nas percentagens de taxas de fertilização, embriões fertilizados (não desenvolvidos) e embriões segmentados (4 células), contrariamente ao decréscimo observado para embriões em estadio de segmentação de 2 células. De igual modo, verificou‐se um decréscimo nos valores obtidos de desenvolvimento larvar normal e tamanho de braços pós‐orais, com o aumento na concentração de óvulos testadas, o que possivelmente poderá estar relacionado com o aumento de densidades de cultivo larvares. Como principal resultado, racios de espermatozóides:óvulos superiores a 300:1, aparentemente influenciam negativamente a segmentação embrionária normal de P. lividus, mas não a morfogénese de echinopluteus de 4 braços, 72 horas após fertilização. Seguidamente, foram avaliadas e testadas várias condições de cultivo larvar de P. lividus, tendo como objectivo a aferição da possibilidade da sua larvicultura em massa. Foram analisados diversos parâmetros (arejamento, mudança de meio de cultivo, dietas, densidades de cultivo e enriquecimento). Como principal resultado, verificou‐se a obtenção de taxas de sobrevivência superiores a 77.0 %, para larvas exotróficas até 6 dias após fertilização, independentemente das densidades de cultivo testadas. De igual modo, taxas de sobrevivência larvar superiores a 52.9 %, aos 18 dias após fertilização, só foram obtidas quando pluteus foram alimentados com D. tertiolecta, a uma densidade de cultivo inicial de 1.5 pluteus.mL‐1 e sob determinadas condições de cultivo (com arejamento e mudança de meio de cultivo a cada 2 dias). Adicionalmente, verificou‐se no que respeita às dietas testadas, que a microalga D. tertiolecta, foi a alimentação que melhores resultados proporcionou, quer em taxas de sobrevivência larvar, quer na percentagem final de pluteus no estadio de 8 braços, após 18 dias de larvicultura, face a dietas microencapsuladas. Adicionalmente verificou‐se a possibilidade de efectuar o enriquecimento de pluteus aos 5 e 10 dias após fertilização, por intermédio da utilização de um produto comercial (Algamac 3050 flake). Como principal resultado, verificou‐se a obtenção de taxas de mortalidade elevadas em larvas exotróficas de P. lividus (5 e 10 dias após fertilização) após a tentativa de enriquecimento com Algamac 3050 Flake, por um período de 12h. De igual modo, verificouse a possibilidade de produção em massa de pluteus (40 pluteus.mL‐1), até 5 e 10 dias após fertilização, por intermédio da utilização da microalga D. tertiolecta e microdietas artificiais (Frippak 1#CAR e Lanzy spirulina+) como fonte de alimentação larvar, tendo‐se verificado valores de sobrevivência larvar baixos (15,1 % e 11,9 %) aos 5 dias após fertilização e 100% de mortalidade aos 10 dias após fertilização, respectivamente, nas experiências em que as dietas artificiais foram usadas como alimento para as larvas exotróficas. Posteriormente, foram efectuadas uma série de experiências com vista ao estudo do potencial da utilização de larvas exotróficas de P. lividus (4 braços), como alimento vivo na larvicultura de crustáceos decápodes marinhos. Deste modo, foram verificadas em primeiro lugar, taxas de ingestão (24 horas) de 5 potenciais predadores (Lysmata seticaudata, Palaemon elegans, Maja brachydactyla, Pachygrapsus marmoratus e Xantho incisus) face a oito presas vivas (ovócitos; gástrulas; pluteus com 4 braços, com 5 e 10 dias após fertilização; pluteus com 6 seis braços, com 12 dias após fertilização; Pluteus com 8 braços, 18 dias após fertilização; Artemia spp. recém‐eclodida; Artemia spp. 24horas após eclosão). Verificou‐se para as espécies de predadores testadas, que unicamente Lysmata seticaudata, Maja brachydactyla, Pachygrapsus marmoratus e Xantho incisus, consumiam estadios larvares de P. lividus. Lysmata seticaudata foi a espécie de predador que ingeriu todas as presas vivas de entre os predadores testados, tendo mesmo sido a única onde se constatou a ingestão de pluteus com 6 e 8 braços. Posteriormente, foi avaliada o desenvolvimento e sobrevivências larvares das espécies Lysmata seticaudata, Maja brachydactyla e Pachygrapsus marmoratus alimentadas com larvas exotróficas de P. lividus (3 e 5 dias após fertilização) vs. Artemia spp. ao longo do cultivo larvar destes crustáceos. Como resultado principal, verificou‐se que as larvas exotróficas de P. lividus permitiram a sobrevivência e desenvolvimento larvar de L. seticaudata até 28 dias após eclosão e estadio IV; M. brachydactyla até 12 dias após eclosão e estadio II; e P. marmoratus até 9 dias após eclosão, não se tendo observado para esta última espécie, o desenvolvimento larvar além do estadio de zoea I. De igual modo, verificou‐se que os equinopluteus exotróficos usados como presas vivas, não permitiram a obtenção de resultados superiores em termos de desenvolvimento e taxas de sobrevivência larvar dos predadores testados, face a Artemia spp.. Por fim foi analisada a possibilidade da utilização de uma determinada característica morfológica externa dos espinhos de P. lividus, com o objectivo de a testar como método não letal na identificação do sexo de organismos adultos desta espécies. Como principal resultado, verificou‐se a não validade desta característica como potencial método de identificação sexual entre machos e fêmeas de P. lividus. Em conclusão, verificou‐se que os estadios larvares exotróficos de P. lividus, testados como potenciais presas vivas na larvicultura de espécies de crustáceos decápodes marinhos, não apresentam nenhuma vantagem adicional como alimento vivo alternativo ou mesmo complementar face a Artemia spp., no que respeita à obtenção de taxas de sobrevivência superiores ao longo do desenvolvimento larvar. Paralelamente e apesar dos resultados obtidos, este estudo contribui para o aperfeiçoamento, desenvolvimento e aplicação de técnicas e/ou métodos em determinadas áreas da investigação, como é exemplo a ecotoxicologia marinha e estuarina, onde gâmetas e estadios de desenvolvimento embrionário e larvar desta espécie, são utilizados como biomodelos.
