Author(s):
Lopes, Filipa Bravo, 1981- 
Date: 2012
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/7270
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Gammaherpesvirinae; Linfócitos B; Sinapses imunológicas; Latência viral; Modulação antigénica; Teses de doutoramento - 2012
Description
Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Biopatológicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2012 A característica biológica principal dos herpesvírus e a sua capacidade de persistirem durante toda a vida do hospedeiro através do estabelecimento de infecções latentes. No caso particular dos gamaherpesvirus a latência é estabelecida preferencialmente em células B de memória. Para conseguir aceder ao compartimento das células B de memória, e assim colonizar o hospedeiro de forma eficiente, os gamaherpesvirus desenvolveram estratégias que visam a exploração do ciclo de vida normal das células B. Em particular, utilizam a reacção de centro germinativo para colonizar os folículos linfóides secundários. Com esse fim, os gamaherpesvirus promovem a activaçãodas células B latentemente infectadas, induzindo a sua proliferação nos centros germinativos e a sua subsequente diferenciação em células B de memória. Estes processos celulares são controlados pela expressão de proteínas virais dedicadas a modulação das vias de sinalização das células infectadas. Uma dessas proteínas e a proteína M2 do herpesvírus de murídeo tipo 4 (MuHV-4). Recentemente demonstrou-se que M2 funciona como uma proteína adaptadora para promover a formação de complexos trimoleculares com as proteínas celulares Vav1 e Fyn, modelando dessa forma a sinalização de células B. Foi também demonstrado que esta acção de M2 e essencial para a colonização dos folículos linfóides, durante o estabelecimento inicial de latência. Para entrar nos folículos linfóides e originar uma reacção de centro germinativo, a célula B necessita de dois tipos de sinais celulares: o sinal de activação resultante da ligação do antigénio ao BCR e os sinais auxiliares de activação e sobrevivência fornecidos pela interacção com as células T helper (Th) CD4+. Uma vez que a acção de M2 é necessária para a eficiente colonização dos folículos, decidimos investigar qual o seu papel, enquanto proteína adaptadora, na modulação destes dois sinais celulares. Os resultados apresentados neste trabalho demonstram que in vivo M2 funciona como uma proteína adaptadora que promove a formação de um sinalossoma de maiores dimensões constituído por PLCγ2, Vav1, p85α, Fyn e NCK1, todas elas proteínas envolvidas na sinalização a partir do BCR. Em consequência da formação deste complexo multiproteico, PLCγ2 e fosforilada em resíduos de tirosina, na ausência de estimulação por antigénio. Os domínios de M2 essenciais para a formacao sinalossoma foram também identificados: a Y120 e os três domínios PxxP C-terminais são cruciais para as interacções proteicas, enquanto a Y129 e igualmente necessária para a indução da fosforilação de PLCγ2. O seguimento da investigação revelou que, no nosso sistema experimental, a proteína M2 polariza para a zona de contacto da sinapse imunológica (SI) formada entre células B e células Th CD4+, e que esta polarização e dependente da tirosina Y120 e dos domínios PxxP C-terminais. Os domínios de M2 essenciais para a formação do sinalossoma são igualmente importantes para promover a polarização do MTOC da célula B para a zona de contacto, o que é indicativo de que sob a influência de M2 a célula B esta mais activada. Os nossos resultados sugerem ainda que, através das suas funções moleculares como proteína adaptadora, M2 modela também o sinal transmitido na SI: aquando da expressão da proteína viral, em celulas B, a quantidade mínima de péptido necessária para activar a célula T é menor, verificando-se ainda uma maior activação da celula Th CD4+. Neste estudo, as funções de M2 na SI foram sempre dependentes da presença de antigénio específico. Em conjunto, os resultados descritos no presente estudo, revelam que M2 é uma proteína adaptadora que promove a formação de um sinalossoma, e que esta função molecular de M2 está envolvida na modulação da activação das células Th CD4+ na SI. No contexto fisiológico da infecção por MuHV-4, a intensificação do sinal transmitido na SI pela célula B pode resultar na atracção da ajuda das células Th CD4+ para as células B infectadas em detrimento das não infectadas. Assim, através das suas funções moleculares, M2 pode conseguir manipular os sinais celulares necessários para a activação e proliferação das células B, latentemente infectadas, nos centros germinativos e para a sua posterior diferenciação em células B de memória. The main biological characteristic of herpesviruses is their ability to persist for the lifetime of the host. To accomplish this herpesviruses establish latent infections, which in the case of gammaherpesviruses are established predominantly in memory B cells. To gain access to the memory B cell compartment and to colonize the host effectively, gammaherpesviruses developed strategies aimed at exploring the normal life cycle of B cells. In particular, they explore the germinal centre reaction in order to colonize secondary lymphoid follicles. As such, gammaherpesviruses promote the activation of latently infected B cells, inducing their proliferation in the germinal centres and their subsequent differentiation into memory B cells. This is achieved by the expression of viral proteins that modulate host cell signaling pathways. One of such proteins is the latency-associated protein M2, encoded by murid herpesvirus-4 (MuHV-4), a gammaherpesvirus of small rodents. Recently, it was shown that M2 functions as an adaptor protein that promotes the assembly of a trimolecular complex with both Vav1 and Fyn, this way modulating the infected B cell signaling pathways. In addition, it was demonstrated that this function of M2 is essential to the colonization of lymphoid follicles during the initial establishment of latency. Two types of signals are necessary for B cells to enter the lymphoid follicles and to originate a germinal centre reaction: the activation signal provided by BCR cross-linking and auxiliary signals provided by helper CD4+ T cells. Since M2 is necessary for the efficient colonization of follicles, we decided to investigate its role, as an adaptor protein, in the modulation of these two cellular signals. Here we show that M2 works in vivo as an adaptor protein that promotes the assembly of a larger multiprotein complex composed by PLCγ2, Vav1, p85α, Fyn and NCK1, all of them proteins that are involved in the signaling pathways downstream of the BCR. As a consequence of the formation of the signalossome, PLCγ2 becomes phosphorylated in tyrosine residues, in the absence of antigenic stimulation. The M2 domains essential for the assembly of the signalossome were also identified: Y120 and the three C-terminal PxxP domains are crucial for the molecular interactions, while Y129 is also necessary for the induction of PLCγ2 phosphorylation. Further investigation on M2 molecular functions, revealed that, in our experimental system, M2 polarizes to the contact site of the immunological synapse (IS) formed between B and helper CD4+ T cells, and that this polarization is dependent on Y120 and the three C-terminal PxxP domains. The M2 domains essential for the assembly of the signalossome are also important to promote the polarization of the B cell MTOC to the contact zone, which suggests that under the influence of M2, the B cell is more activated. Our results further suggest that, through its molecular functions as an adaptor protein, M2 modulates the signal transmitted at the IS: M2 expression in B cells lowers the peptide threshold for T cell activation; also helper CD4+ T cells were more activated. In our experimental conditions, M2 functions at the IS were always dependent on the B cell presentation of cognate antigen. Taking together, the results presented here reveal that M2 is an adaptor protein that promotes the assembly of a signalossome. This molecular function of M2 is involved in the modulation of helper CD4+ T cells activation at the IS. In the physiological context of infection, the more intense signal transmitted at the IS by B cells may result in the attraction of T cell help to infected B cells in detriment of the uninfected ones. Thus, through its molecular functions, M2 may manipulate both cellular signals crucial for the activation and proliferation of latently infected B cells, in the germinal centres, and for its ensuing differentiation into memory B cells.
