Author(s):
Amaro, Joana Paula Gomes, 1988- 
Date: 2012
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/7249
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Embriologia animal; Biologia celular; Teses de mestrado - 2012
Description
Tese de mestrado.Biologia (Biologia Evolutiva e do desenvolvimento), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012 A somitogénese é um processo característico do desenvolvimento embrionário dos vertebrados durante o qual segmentos repetidos, denominados somitos, são gerados de forma periódica, sob o controlo temporal imprimido por um Relógio Molecular, primeiramente descrito pela expressão cíclica do gene hairy1. O nosso laboratório identificou uma interacção proteica entre Hairy1 e Brachyury (T), um marcador de identidade mesodérmica. T regula e é regulado pela sinalização FGF e desempenha um papel fundamental na activação da expressão dos genes de identidade Hox. Este resultado levantou a hipótese de que Hairy1 e T interagem ao longo do desenvolvimento, aliando informação temporal e posicional. Para prosseguir o estudo desta hipótese, neste trabalho realizou-se a caracterização da interacção proteica entre Hairy1 e T in vivo por Bimolecular Fluorescent Complementation (BiFC), identificando a sua localização subcelular e os domínios proteicos envolvidos. Os resultados mostram que o dímero T:Hairy1 é exclusivamente nuclear, que a homodimerização de Hairy1 ocorre no núcleo e no citoplasma, e sugerem que a porção bHLHOR é suficiente para estas interacções. Os padrões de expressão de hairy1 e T apresentam domínios de co-expressão ao longo do desenvolvimento, corroborando um possivel papel funcional para a interacção entre as duas proteínas. Observou-se que a expressão de T apresenta um gradiente de mRNA na mesoderme pré-somitica (PSM), sendo que o seu dominio de transcrição activa se revelou mais restrito ao botão caudal, assim como foi descrito para fgf8. A caracterização da dinâmica temporal da expressão de T e fgf8 revelou que estes genes apresentam pulsos de transcrição, com periodicidade diferente de 90min. Verificou-se ainda que a ausência da notocorda por 90min e 4,5h, provoca uma diminuição da transcrição e da expressão de mRNA maduro em T e fgf8, sendo mais acentuada para fgf8. Globalmente, estes resultados sugerem que T e fgf8 possuem mecanismos de regulação da expressão na PSM muito semelhantes. Somitogenesis is a characteristic process of vertebrate embryo development whereby repeated segments, called somites, are generated with a tight temporal control dictated by a Molecular Clock, primarily described by hairy1 gene expression oscillations. Our lab found that Hairy1 protein interacts with the mesoderm marker Brachyury (T). T is involved in a positive feed-back loop with FGF signaling and plays a fundamental role on Hox gene expression activation. This raised the hypothesis that Hairy1 and T may interact throughout development, linking temporal and positional information. To pursue studying this hypothesis, in this work we performed the characterization of Hairy1 and T protein interaction in vivo by Bimolecular Fluorescent Complementation (BiFC), identifying its subcelular localization and the protein domains involved. Our results show that the T:Hairy1 dimer is exclusively nuclear, that Hairy1 homodimeriziation occurs in both nucleus and cytoplasm, and that the bHLHOR portion of Hairy1 is sufficient for these interactions to occur. hairy1 and T reveal domains of co-expression during development, supporting a functional role for the interaction among their proteins. We found that T expression presents a mRNA gradient in the pre-somitic mesoderm (PSM) and that its transcription domain appeared more restricted to the tail bud, as previously described for fgf8. Characterization of the temporal dynamics of T and fgf8 expression showed that both genes present transcriptional pulses, with a periodicity that differs from 90min. Additionally, we observed that notochord ablation for 90min and 4,5h resulted in a decrease of transcription and mature mRNA expression of both T and fgf8, although to greater extent for fgf8. Overall, our results evidence that T and fgf8 seem to share similar regulatory gene expression mechanisms in the chick PSM.
