Author(s):
Santos, Andrea Sofia Rebelo, 1980- 
Date: 2011
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/6582
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Biologia molecular; Expressão génica; Helycobacter pylori; Virulência; Teses de mestrado - 2011
Description
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011 Neste trabalho pretendeu-se estudar a diversidade genética e evolução dos genes hopM e hopN, que codificam proteínas de membrana externa de H. pylori, bem como contribuir para o esclarecimento do seu papel na virulência desta bactéria, através da identificação de possíveis associações a patologias específicas e a marcadores moleculares de virulência (cagA e vacAs1). Foi utilizado um painel de 234 estirpes clínicas e sequências de 23 estirpes de referência, isoladas de doentes de origem geográfica diferente e com diversas patologias gástricas. A reconstrução filogenética destes dois genes sugere evolução divergente entre eles. Em cada um dos genes, foram identificados dois clusters predominantes, sendo a segregação entre eles motivada pela origem geográfica das estirpes, havendo uma diferenciação clara entre as estirpes de origem ocidental e as de origem asiática. Foi observada diversidade relativamente ao número de cópias de cada gene e à sua localização genómica, sendo esta diferença notória entre grupos geográficos diferentes. Na população ocidental ambos os genótipos, de cópia única e dupla cópia (mesmo gene ou genes diferentes), foram observados. Contrariamente, na população asiática apenas foram observados os genótipos de cópia única, enquanto no grupo africano apenas os genótipos de dupla cópia foram apresentados. Apesar de nenhum destes genótipos ser marcador da doença gastroduodenal, observou-se uma associação estatisticamente significativa, na população ocidental, entre a dupla cópia hopN e o genótipo mais virulento, e entre a dupla cópia hopM e o genótipo menos virulento. No grupo de origem oriental, não se observou nenhuma associação estatisticamente significativa com o perfil de virulência da estirpe. A análise das sequências dos dois genes sugere a sua regulação por variação de fase e ainda a possibilidade da ocorrência de fenómenos de recombinação intragenómica ou intergenómica, podendo os mecanismos de duplicação ou conversão génica estar implicados na regulação da sua expressão. Os genes hopM e hopN revelaram um elevado grau de similaridade entre si, com uma distância molecular de 0,146±0,006 ao nível da sequência de nucleótidos e de 0,161±0,011 ao nível da sequência de aminoácidos. Dentro de cada gene, verificou-se um grau de conservação ainda superior, com distâncias moleculares e taxas de substituições de nucleótidos muito similares, quando comparados os valores obtidos para cada gene. Verificou-se ainda uma taxa superior de substituições sinónimas (Ks) do que não sinónimas (Ka), sendo a razão Ka/Ks inferior a um, o que aponta para a existência de uma pressão evolutiva para a conservação destes genes, através da acção da selecção negativa ou purificadora. Foram identificadas quatro variantes alélicas, comuns a ambos os genes, designadas por AI, AII, AIII e AIV. No geral, foram observados dois alelos predominantes, os alelos AI (39,2%) e o AII (42%,), enquanto os alelos AIII e AIV, putativos recombinantes dos alelos AI e AII, foram observados com menor frequência nas estirpes estudadas (12,9% e 5,8%, respectivamente). Na população ocidental e africana todos os alelos foram observados, sendo o mais prevalente o alelo AI (49,8% e 69,6%, respectivamente). Nestas populações não se verificou nenhuma associação entre as variantes alélicas e a patologia. No entanto, na população ocidental, os alelos AII e AIII foram significativamente associados com o genótipo de virulência da estirpe, mais concretamente o alelo AII com o genótipo menos virulento e o AIII com o genótipo mais virulento. Na população asiática, o alelo AII foi o mais prevalente (85,2%) e o alelo AIV não foi observado. Nesta população, não se verificou nenhuma associação com suporte estatístico, entre as variantes alélicas e a patologia gástrica ou o grau de virulência da estirpe. Globalmente estes resultados sugerem que hopM e hopN fazem parte do grupo de genes que codificam OMPs de H. pylori implicadas tanto na interacção da bactéria com o seu hospedeiro humano, como na variação antigénica, contribuindo para a persistência e sucesso da infecção. Mais, as variantes alélicas podem constituir biomarcadores de virulência da estirpe em determinadas populações. This work aimed to study the genetic diversity and evolution of hopM and hopN genes, which encode outer membrane proteins of H. pylori, as well as contribute to the clarification of its role in the virulence of this bacterium, by identifying possible associations to specific diseases and virulence markers (cagA and vacAs1). We used a panel of 234 clinical strains and of 23 reference strains sequences isolated from patients from different geographical origins and presenting different gastroduodenal pathologies. The phylogenetic reconstruction of these two genes suggests a divergent evolution between them. It also revealed a geographic segregation in each gene, with two dominant clusters, with a clear differentiation among strains of Western and East Asian origin. Diversity was observed regarding the number of copies and their genomic localization, with East Asian and Western strains presenting different genotypes. In the Western strains both, the single and double copy genotypes were observed. In contrast, in the East Asian group, only the single copy was presented, while in the African group only the double copy genotype was observed. While no association was found between these genotypes and gastroduodenal disease, statistically significant associations between the hopN double copy genotype and the more virulent profile, and between the hopM double copy genotype and the less virulent profile, were observed in the Western group. In the East Asian group, there was no association between hopM/hopN genotypes and the virulence profile of the strain. The sequence analysis of these genes suggests regulation by phase variation. It also indicates possible recombination events, leading to gene duplication or hopM/hopN conversion which may be implicated in the regulation of these genes as well. The hopM and hopN genes revealed a high degree of similarity between them, with a moelcular distance of 0,146±0,006 at nucleotide level and of 0,161±0,011 at the aminoacid level. Within each gene, there was an even higher degree of conservation, with very close molecular distances and rates of nucleotide substitutions, when comparing the values obtained for each gene. It was observed a higher level of synonymous substitutions (Ks) than non-synonymous (Ka), and the ratio Ka/Ks<1, suggests an evolutionary pressure to maintain the two genes by negative or purifying selection. Four allelic variantes were identified in both genes and in all strains studied although with different frequencies. In general, two dominant alleles were observed, alleles AI (39,3%) and AII (42%), and two less predominant, putative recombinants of the dominant variants, alleles AIII (12,9%) e AIV (5,8%). In Western and in African strains all the alleles were observed, althoug the AI allele was the most frequently found (49,8% and 69,6%, respectively). In these populations, there were no correlation between any allele and disease. However in the Western group, AII and AIII alleles were statiscally associated with the virulence genotype of the strain, more specifically, the AII allele with the less virulent genotype and AIII with the most virulent genotype. In East Asian strains, the allele AII was the most prevalent (85,2%) and the allele AIV was not observed. In this group, despite the apparent associations between some allelic variants and certain diseases, no statistical association was observed, nor between hopM/hopN alleles and the virulence genotype of the strain. Overall, the results of this study suggest that hopM and hopN are good candidates to be part of the pool of H. pylori OMPs implicated in host-bacteria interface and also contributing to the generation of antigenic variability, and thus involved in persistence and success of H. pylori infection. Moreover, some allelic variants may constitute biomarkers of the virulence of the strain in some populations.
