Autor(es):
Henriques, Catarina Martins de Oliveira, 1983- 
Data: 2009
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/6501
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Interleucina-7; Receptores de Interleucina-7; Homeostase; Movimento celular; Linfócitos T; Leucemia-Linfoma linfoblástico de células precursoras; Teses de doutoramento - 2010
Descrição
Tese de doutoramento, Ciências Biomédica (Ciências Biopatológicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2010 Although leukaemia arises in the bone marrow, patients often present infiltration of other organs, such as the spleen, CNS, liver, lungs and peripheral blood. Mechanisms of cell migration, invasion, vasculogenesis and angiogenesis have been shown to play a crucial role in haematological cancers. Moreover, micro-environmental factors such as chemokines and cytokines were already shown to enhance T-cell acute lymphoblastic leukaemia (T-ALL) viability, proliferation and migration. Interleukin 7 (IL-7) is a key prosurvival cytokine essential for T-cell proliferation, development and homeostasis. Because IL-7 is produced at the sites of T-cell development, and also other organs to which leukaemia cells disseminate, it has the potential to modulate growth and homing of malignant T-cells. In this study, we used T-ALL cell lines and primary human thymocytes to assess whether IL-7 impacted on T-cell motility and migration. Our work suggests, for the first time, that IL-7 enhances T-ALL cell motility, as assessed by time-lapse microscopy. Furthermore, IL-7 has the capacity to direct T-ALL cell migration, acting as a chemoattractant in a transwell assay, in a dose-dependent manner. In constrast, IL-7 does not significantly affect the migration of normal thymocytes. Exploring this intriguing difference may thus provide new therapeutic targets to hinder T-ALL cell migration and, possibly, metastasis. In order to better understand the kinetics of IL-7-induced T-cell migration it is crucial to understand the kinetics of IL-7 signalling, which can affect T-cell migration, potential IL-7 consumption and general T-cell homeostasis. Many receptors are known to be down-regulated in response to ligand, and this response may be critical for signalling kinetics. It has been described that long term exposure to IL-7 leads to a transcriptional down-regulation of its cognate receptor in T-cells. Surprisingly, however, it is currently unknown how IL-7 regulates the trafficking and turnover of Interleukin 7 Receptor alpha (IL-7RD) at early time points. In the present study, we used human T-ALL cell lines to investigate the fate of IL-7RD upon ligand binding. We show that IL-7 induces rapid receptor internalization via clathrin-coated pits and subsequent lysosome and proteasomedependent degradation, evident as early as 15 minutes. This contrasts with the steady-state situation, where IL-7RD slowly internalizes and mostly recycles to the surface. Accordingly, the half-life of IL-7RD is dramatically reduced from roughly 24h in unstimulated cells to around 3 hours upon IL-7 stimulation. Interestingly, IL-7-induced x signalling is inhibited when clathrin-dependent endocytosis is repressed by hyperosmotic sucrose. Moreover, pre-treating T-cells with a Janus Kinase 3 (JAK3) inhibitor suggested that IL-7RD degradation is, at least partially, dependent on JAK3 activation. These findings indicate that IL-7RD endocytosis is required for IL-7-mediated signalling and that, in turn, signalling-dependent mechanisms determine whether the receptor is targeted for degradation or recycled to the surface. Overall, this study explores for the first time the mechanisms of IL-7-dependent IL-7RD trafficking, contributing to the in-depth understanding of the biology of the IL-7R and its ligand in lymphocyte function. Embora a leucemia tenha origem na medula óssea, doentes com este tipo de cancro apresentam frequentemente infiltração de órgãos como o baço, sistema nervoso central e pulmões. Por detrás deste fenómeno estão mecanismos de migração celular, vasculogénese e angiogénese que, tal como em tumores sólidos, contribuem para a ‘metastização’ dos cancros hematológicos. Para além de factores intrínsecos às células malignas, o microambiente tumoral desempenha um papel crucial no desenvolvimento desta doença. Vários estudos demonstram que a produção de quimiocinas e citocinas contribuem positivamente para a viabilidade, proliferação e migração de células de Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA-T). A interleucina 7 (IL-7) é uma citocina essencial para a sobrevivência, proliferação e homeostasia de células T. Além disto, diferentes estudos demonstram que a IL-7 é um factor crucial na sobrevivência, proliferação e crescimento de células LLA de linhagem T (LLA). Uma vez que a IL-7 é produzida no microambiente de desenvolvimento de células T e nos nichos de infiltração de LLA-T, esta citocina tem o potencial de regular não só sobrevivência e crescimento, mas também a migração de células T normais e leucémicas. Neste estudo usámos linhas celulares humanas de LLA-T e timócitos primários humanos para avaliar o impacto directo da IL-7 na mobilidade e migração destas células. O presente trabalho sugere, pela primeira vez, que a IL-7 aumenta a mobilidade de células LLA-T, avaliada por microscopia em tempo-real. Para além disto, a IL-7 é capaz de atrair as células LLA-T em função da dose, agindo como agente quimiotáctico em ensaios in vitro. Pelo contrário, a IL-7 mostrou não afectar significativamente a migração de timócitos normais, o que levanta a possibilidade de haver diferenças cruciais na regulação da mobilidade destas células. Um estudo mais aprofundado destes mecanismos poderá assim identificar novos alvos para inibir a migração e potencial desenvolvimento de LLA-T. Para compreender os mecanismos pelos quais a IL-7 poderá activar a migração celular, é importante conhecer a cinética de transdução de sinal induzida por esta citocina. Por seu turno, a sinalização induzida por um ligando, qualquer que ele seja, está intrinsecamente dependente da regulação da expressão do receptor específico à superfície celular. Uma característica comum na interacção do ligando com o seu receptor é o decréscimo da expressão do mesmo à superfície, que pode frequentemente influenciar a cinética da cascata de sinalização e resposta celular. Apesar de se saber que a exposição xii prolongada à IL-7 leva ao decréscimo transcricional da cadeia alfa do seu receptor (IL- 7RD), a dinâmica do tráfego e expressão do receptor à superfície na fase inicial do estímulo são desconhecidos. A regulação deste mecanismo, que é normalmente muito rápido em resposta ao ligando, pode ser crucial na cinética de sinalização mediada pela IL-7 e ter um impacto considerável em diversos aspectos do funcionamento da célula T, incluindo mecanismos de migração. Neste estudo procedemos à caracterização do tráfego membranar e subsequente expressão e reciclagem do receptor da IL-7 em resposta à IL-7. As nossas experiências demonstram, pela primeira vez, que a IL-7 induz a internalização da cadeia alfa do seu receptor por vesículas de clatrina, seguida de degradação dependente de proteasomas e lisosomas, levando a um decréscimo rápido da expressão do receptor. Pelo contrário, na ausência de ligando, IL-7RD internaliza constitutivamente, mas regressa na sua maioria à superficie celular. Como resultado, a semi-vida do IL-7RD decresce de 24h em células não estimuladas para 3h em células tratadas com IL-7. Salientando a relevância funcional deste mecanismo, verificamos que, ao inibirmos a formação de vesículas de clatrina e, consequentemente, a internalização do IL-7RD, ocorre também inibição da cascata de sinalização mediada pela IL-7. Além disto, ao inibirmos JAK3, uma das cinases responsável pelo início da cascata de sinalização induzida pela IL-7, inibimos parcialmente a degradação do IL-7RD. Estas observações indicam que a internalização do IL-7RD é necessária para uma sinalização eficiente e que por sua vez, os mecanismos de sinalização são cruciais para a regulação da degradação deste receptor. Em resumo, o nosso estudo identifica os mecanismos envolvidos na regulação de tráfego e expressão à superfície do IL-7RD em resposta à IL-7, o que contribui para a compreensão da biologia do IL-7R e da IL-7 na regulação de células T.
