Author(s):
Neves, Joana Matos das, 1988- 
Date: 2011
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/6460
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Neurogénese; Embrião de galinha; Bioinformática; Proteínas; Biologia molecular; Teses de mestrado - 2011
Description
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011 During spinal cord (SC) embryonic development, several excitatory and inhibitory interneurons (INs) are generated but the molecular mechanisms underlying such cell diversity remain poorly understood. One of the mechanisms that has been involved in the generation of neuronal diversity is the cell-cell signalling mediated by the Notch pathway. Particular attention has been given to the V2 domain of SC since: i) instead of one ligand (as observed in the remaining domains), two Notch ligands (Delta-like 1 and Delta-like 4) are expressed and ii) three molecularly distinct subtypes of INs, V2a, V2b and V2c, are generated from apparently common progenitors. How Delta-like 4 (Dll4) expression is regulated and how IN specification is controlled in the V2 domain are the main focus of this thesis. To address these questions, the chick embryo was used as model organism. Using available databases and bioinformatics tools, we compared chick and mouse Dll4 promoter sequences. We identified preferred E-boxes for the binding of Mash1 and Neurogenins, two of the main proneural bHLH proteins, predicting that these proteins may regulate Dll4 expression. To test this hypothesis, we overexpressed Mash1, NGN1 and NGN2 in the chick developing SC. We show that Mash1 and NGN1 are able to activate Dll4 expression whereas NGN2 is not. As proneural proteins are involved in IN specification, we analysed the number of V2a INs after overexpressing these proteins. We show that while Mash1 represses V2a IN fate, NGN1 and NGN2 promote this fate. Moreover, as HES proteins (another bHLH protein family member) have been shown to bind to E-boxes, we tested if HES6-2 could regulate Dll4 expression and found that it might act as a repressor of Dll4. To further investigate how Dll4 expression is regulated, we generated a fluorescent reporter using the 3310bp sequence localized upstream of the Dll4 coding region as a promoter sequence. This reporter failed to reflect endogenous Dll4 expression, indicating that for the accurate expression of Dll4, there must be essential regulatory sequences outside the 3310bp upstream of the Dll4 coding region. This thesis presents new evidences on how Dll4 expression can be regulated by different proneural proteins and HES6-2 protein and what may be their contribution to V2 interneuron specification. This study provides new insights on how neurogenesis is controlled in the V2 domain of the developing SC. O Sistema Nervoso Central é um sistema muito complexo sendo constituído por um grande número e variedade de células - neurónios e células da glia - as quais são, na sua grande maioria, produzidas durante o desenvolvimento embrionário. Estas células têm de ser geradas no momento e posição correctos, de forma a interagirem entre si e a formarem circuitos funcionais. Durante o desenvolvimento da espinal medula, um grande número de interneurónios excitatórios e inibitórios são gerados, mas os mecanismos moleculares subjacentes a esta diversidade celular são ainda pouco conhecidos. No entanto, sabe-se que a via de sinalização Notch desempenha um papel essencial durante o desenvolvimento do Sistema Nervoso Central. A via de sinalização Notch é um sistema de comunicação célula-a-célula que ocorre através do contacto directo entre duas proteínas membranares: o receptor Notch e os seus ligandos (Delta ou Serrate). Quando um ligando de uma célula interage com o receptor de outra célula desencadeia uma série de clivagens proteolíticas que levam à libertação do domínio intracelular do receptor Notch (NICD). O NICD é translocado para o núcleo onde se associa a outros factores (CSL e Mastermind) para activar a expressão de genes alvo, como os genes Hes. Na ausência de NICD, a proteína CSL actua como repressor transcricional dos mesmos genes. Actualmente, a função melhor caracterizada da via de sinalização Notch é a manutenção de progenitores neurais durante a neurogénese. A decisão de uma célula permanecer como progenitor ou diferenciar é controlada pelo balanço de dois tipos de factores de transcrição: proteínas proneurais, que promovem a diferenciação, ou proteínas HES, que reprimem a diferenciação neural. Uma célula ao expressar elevados níveis de proteínas proneurais vai iniciar o processo de diferenciação. Como estas proteínas activam a expressão de ligandos Notch, esta célula vai expressar elevados níveis de ligandos e vai activar a via Notch nas células vizinhas. Como consequência da activação desta via, estas células vão expressar elevados níveis de proteínas HES e vão permanecer como progenitores. Desta forma, a célula que expressa o ligando Notch diferencia-se em neurónio mas simultaneamente assegura que as células vizinhas se mantenham como progenitores. Visto que a neurogénese ocorre durante uma larga janela temporal, a manutenção de uma população de progenitores permite que estas células sejam expostas a diferentes estímulos e, como tal, diferenciem em diferentes neurónios durante o desenvolvimento. Evidências recentes mostram que a via Notch está também envolvida na especificação de células neurais, nomeadamente na especificação de interneurónios no domínio V2 da espinal medula. Neste domínio, três interneurónios, V2a, V2b e V2c, são produzidos a partir de progenitores comuns. Na ausência de sinalização Notch, apenas os interneurónios V2a são produzidos, o que indica que a sinalização Notch é necessária para a produção dos interneurónios V2b (os interneurónios V2c foram identificados recentemente e, como tal, não existem muitos dados disponíveis sobre esta linhagem). Curiosamente, nesta fase do desenvolvimento, este é o único domínio onde se sabe que diferentes interneurónios são simultaneamente produzidos e o único domínio onde dois ligandos da via Notch são expressos: Delta-like 1 (DLL1) e Delta-like 4 (DLL4). Pensa-se que o ligando DLL1 esteja envolvido na activação da via Notch e consequente manutenção de progenitores, enquanto o ligando DLL4 estará provavelmente envolvido na especificação dos interneurónios. Como é que a expressão de Dll4 é regulada no domínio V2 da espinal medula e como é que a especificação de interneurónios é controlada neste domínio são os principais temas investigados nesta tese. O organismo modelo utilizado para estudar estas questões foi o embrião de galinha. Recorrendo à técnica de hibridação in situ, mapeámos a expressão de Dll4 na espinal medula durante o desenvolvimento embrionário da galinha. O mRNA deste gene não foi detectado em células neurais da espinal medula no dia embrionário 2 (E2) nem no E3. No entanto, foi detectado no E4 na zona ventricular do domínio V2. Inesperadamente, observámos expressão de Dll4 em vários domínios dorsais e ventrais no E6, o que sugere que este ligando poderá estar envolvido na manutenção de progenitores ou na especificação de interneurónios produzidos mais tarde no desenvolvimento embrionário da galinha. Visto que as sequências importantes para a regulação da expressão de um gene tendem a ser conservadas entre diferentes espécies, utilizámos ferramentas bioinformáticas e bases de dados disponíveis para comparar as sequências do promotor do gene Dll4 de ratinho e galinha. Esta análise revelou que o nível total de semelhança destas sequências entre as duas espécies é baixo, tendo sido apenas possível identificar 5 regiões com semelhança superior a 60%. Nestas regiões conservadas foram identificadas E-boxes, sequências consenso às quais se ligam proteínas proneurais e proteínas HES. Uma análise mais detalhada permitiu identificar sequências consenso específicas para a ligação das proteínas proneurais Mash1 e Neurogeninas (NGN), o que sugere que estas proteínas possam estar directamente implicadas na regulação da expressão de Dll4. Para testar esta hipótese, as proteínas Mash1, NGN1 e NGN2 foram sobre-expressas na espinal medula de embriões de galinha no estádio HH17-18 pela electroporação in ovo de plasmídeos que codificam estas proteínas. Utilizando a técnica de hibridação in situ foi possível observar que tanto Mash1 como NGN1 promovem a expressão ectópica de Dll4 e, como tal, regulam positivamente a sua expressão. No entanto, após a sobre-expressão de NGN2, não se verificou nenhuma alteração na expressão endógena de Dll4, indicando que esta proteína proneural não será um factor importante no controlo da expressão deste gene. Visto que as proteínas proneurais controlam a especificação de neurónios durante o desenvolvimento de Sistema Nervoso Central, analisámos se depois da sobre-expressão destas proteínas o número de interneurónios V2a produzidos é alterado. Após a sobre-expressão de Mash1, observámos uma diminuição no número de interneurónios V2a, indicando que Mash1 reprime, directa ou indirectamente, a produção destes interneurónios. Contrariamente, observámos que, após a sobre-expressão de NGN1 e NGN2, o número de interneurónios V2a aumenta, o que sugere que as proteínas NGN1 e NGN2 promovem directamente a diferenciação de interneurónios V2a. As proteínas HES também se ligam a E-boxes e, como tal, podem estar envolvidas na regulação da expressão de Dll4. Visto que a proteína HES6-2 actua como repressor negativo da via Notch e é expressa ao longo do eixo dorso-ventral da espinal medula, esta proteína pode estar envolvida na regulação da expressão de Dll4 impedindo a sua expressão não só fora do domínio V2 no E4, mas também nos interneurónios V2b. A proteína HES6-2 contém um domínio repressor (WRPW) responsável pela sua actividade repressora. Para testar se esta proteína funciona como repressor transcricional do gene Dll4, utilizámos uma forma dominante negativa, na qual o domínio repressor WRPW foi substituído por um domínio transactivador - VP16. Esta proteína (HES6-2:VP16), em vez de reprimir, activa a transcrição dos genes alvo. HES6-2:VP16 foi sobre-expressa na espinal medula de galinha no estádio H17-18 pela electroporação in ovo de um plasmídeo que codifica esta proteína. Utilizando a técnica de hibridação in situ, observámos expressão ectópica de Dll4, indicando que a proteína HES6-2 reconhece o promotor deste gene e regula negativamente a sua expressão. Paralelamente, gerámos um repórter fluorescente da expressão de Dll4. No entanto, utilizando a sequência de 3310pb localizada a montante da região codificante do gene Dll4 de galinha como sequência promotora, não conseguimos gerar um repórter cuja expressão do gene repórter (Venus) reflicta a expressão endógena do gene Dll4. Como tal, poderão existir sequências regulatórias necessárias para a correcta expressão de Dll4 (nos estádios analisados) que não se encontram localizadas nos 3310pb a montante da região codificante deste gene. Sabe-se que as regiões regulatórias podem estar localizadas vários kb a montante do promoter, em intrões ou mesmo a jusante da região codificante. Como tal, é necessário fazer uma análise mais alargada do locus Dll4 para tentar identificar novas regiões conservadas que possam conter sequências regulatórias necessárias à correcta expressão do gene Dll4. Este estudo apresenta novas evidências sobre a função que diferentes proteínas proneurais e a proteína HES6-2 têm na regulação da expressão de Dll4 e na especificação de interneurónios no domínio V2. Estes resultados fornecem dados para uma futura análise detalhada de como a neurogénese se processa neste domínio.
