Author(s):
Manso, Helena Isabel Gomes Pires, 1984- 
Date: 2011
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/4596
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Acidente vascular cerebral; Genes; Interacções epistáticas; Recuperação; Teses de doutoramento - 2011
Description
Tese de doutoramento, Biologia (Genética), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011 Stroke is a significant cause of death and disability in developed countries. It is a multifactorial disease, resulting from the interplay between genes and well-known life-style/environmental risk factors. Numerous studies have attempted to identify the genetic risk factors predisposing to stroke, but few have investigated the genetic factors involved in stroke outcome. This work aimed at the identification of genes contributing to stroke and influencing patient’s outcome after three months. Four inflammatory genes (IL1B, IL6, MPO and TNF) and two genes involved in the nitric oxide metabolism (NOS1 and NOS3) were tested for association with stroke. The results suggest that the IL6 and MPO genes influence stroke susceptibility through independent effects and non-additive interactions. Furthermore, they provided novel evidence for the involvement of the NOS1 gene in stroke susceptibility. Several studies have shown the important impact of oxidative stress, inflammation, angiogenesis, neurogenesis, neurovascular damage and neurovascular remodeling for stroke-associated brain damage and/or stroke recovery. Association analyses were thus carried out to assess the role of candidate genes involved in inflammatory processes (IL1B, IL6, MPO and TNF) and oxidative stress (NOS1 and NOS3), as well as matrix metalloproteinase genes (MMP2 and MMP9) and growth factor genes (BDNF, FGF2 and VEGFA) in patient’s outcome at three months. MMP2 genetic variants were found associated with patient’s outcome, and the results also indicate that two epistatic interactions between the BDNF and FGF2 genes and between the FGF2 and VEGFA genes influence this phenotype. A genome-wide association study was performed in stroke outcome using DNA pooled samples to provide novel insights into the mechanisms involved in stroke recovery. The BBS9 and GLIS3 genes were found associated with patient’s outcome at three months. Taken together, these results suggest that stroke susceptibility and outcome are modulated by a combination of main gene effects and gene-gene interactions, independently of stroke risk factors and/or severity parameters, highlighting the complexity of mechanisms predisposing to stroke and influencing recovery afterwards. O Acidente Vascular Cerebral (AVC) é uma das principais causas de morte e incapacidade permanente nos países desenvolvidos, tendo importantes consequências económicas e sociais. O AVC é considerado uma doença complexa, que resulta de uma acção combinada entre genes e factores de risco ambientais ou de estilo de vida. Muitos estudos foram já levados a cabo com o intuito de identificar os factores genéticos de risco para o AVC, mas os resultados têm sido inconsistentes. A maioria desses estudos analisou o papel de genes candidatos; mais recentemente, foram também realizados estudos de associação ao nível de todo o genoma. Ao contrário da susceptibilidade, poucos estudos procuraram identificar quais os factores genéticos envolvidos na recuperação após um AVC. Este trabalho de doutoramento pretendeu assim identificar genes que contribuam para a susceptibilidade ao AVC e que influenciem o estado de incapacidade funcional (outcome) do doente ao fim de três meses de recuperação. Para isso, foram utilizadas duas estratégias distintas. A primeira estratégia consistiu na análise do papel de genes candidatos nos dois fenótipos referidos anteriormente, genes esses que tinham sido escolhidos com base na sua função, nos resultados de estudos de associação anteriores e/ou nos resultados de estudos com modelos animais de AVC, factores de risco ou condições médicas associadas. Foi ainda realizado um estudo de associação ao nível de todo o genoma com o objectivo de identificar factores genéticos que influenciem o outcome do doente. Nesta segunda estratégia não existia uma hipótese a priori relativamente ao papel de um determinado gene no fenótipo, correspondendo por isso a uma análise não enviesada. Vários estudos têm sugerido que a inflamação e o stress oxidativo desempenham um papel relevante na susceptibilidade ao AVC. Factores de risco já conhecidos, como aterosclerose, diabetes, obesidade e hipertensão, estão associados a um perfil inflamatório elevado. Além disso, é também conhecida a importância das enzimas sintase do óxido nítrico (NOS) para a aterosclerose e a regulação da pressão sanguínea. Atendendo a isso, foi testada a associação de quatro genes inflamatórios (IL1B, IL6, MPO e TNF) e de dois genes envolvidos no metabolismo do óxido nítrico (NOS1 e NOS3) com o risco de AVC. Foram encontradas associações de variantes genéticas nos genes inflamatórios IL6 e MPO com a doença, assim como de uma interacção epistática entre eles contribuindo para o risco. Isto sugere que os dois genes influenciam a susceptibilidade ao AVC através de efeitos independentes e de efeitos de interacção não aditivos. Os resultados mostram ainda uma associação entre o AVC e variantes genéticas no gene NOS1, que codifica uma das isoformas de NOS. A análise de genes candidatos sugere assim que efeitos independentes dos genes inflamatórios ou de stress oxidativo IL6, MPO e NOS1, e efeitos não aditivos resultantes de interacções entre os genes IL6 e MPO têm um impacto na susceptibilidade ao AVC. Estes resultados são compatíveis e reforçam as observações feitas em estudos in vitro e in vivo relativamente ao papel da inflamação e do stress oxidativo nesta doença. É igualmente reconhecido o importante impacto de stress oxidativo, inflamação, angiogénese, neurogénese, dano e remodelação neurovasculares na lesão cerebral associada ao AVC e/ou na recuperação funcional dos doentes. Assim, foram também levados a cabo estudos de associação para avaliar o papel de genes candidatos envolvidos em processos inflamatórios (IL1B, IL6, MPO e TNF) e de stress oxidativo (NOS1 e NOS3), assim como de genes das metaloproteinases da matriz (MMPs) (MMP2 and MMP9) e de genes de factores de crescimento (BDNF, FGF2 and VEGFA), no outcome do doente após três meses de recuperação. Relativamente ao gene MMP2, os resultados mostram a associação entre variantes genéticas deste gene e o outcome do doente após três meses de recuperação. Vários estudos anteriores demonstraram que a ruptura da barreira hemato-encefálica associada ao AVC está relacionada com a expressão e activação de MMPs, levando a hemorragia, edema e morte celular. No entanto, outros estudos sugerem que a actividade destas proteínas pode ser benéfica na angiogénese e na remodelação neurovascular em fases tardias de recuperação, o que poderá contribuir para a recuperação funcional do doente. Neste trabalho de doutoramento foram ainda identificadas duas interacções epistáticas entre os genes BDNF e FGF2 e entre os genes FGF2 e VEGFA em associação com o outcome do paciente. Estes três genes codificam factores de crescimento que são partilhados pelo sistema nervoso e vascular e que afectam a homeostasia e desenvolvimento dos dois sistemas. Os factores de crescimento têm importantes funções ao nível da angiogénese, neurogénese e protecção neuronal, influenciando o estado neurológico dos doentes e a recuperação dos mesmos após o AVC. Tendo em conta estes resultados, a análise de genes candidatos sugere que o gene MMP2 e interacções epistáticas entre os genes BDNF e FGF2, e entre os genes FGF2 e VEGFA têm um impacto no outcome do doente ao fim de três meses de recuperação. Estes resultados são também compatíveis com estudos in vitro e in vivo que tinham demonstrado previamente a importância das MMPs e dos factores de crescimento na recuperação após um AVC. Foi feito um rastreio genómico com o objectivo de identificar factores genéticos que influenciem o outcome do doente. Para isso foi testada a associação de mais de 250 mil polimorfismos, localizados ao longo de todo o genoma, com o outcome do doente. Uma das vantagens desta estratégia é a de possibilitar a descoberta de novos mecanismos envolvidos neste fenótipo. Para realizar este estudo de uma forma economicamente eficiente foram analisados conjuntos (pools) de amostras de DNA de doentes. Após a identificação dos marcadores mais importantes com base em quatro estratégias distintas, esses resultados foram validados por genotipagem individual. Este estudo permitiu a identificação de uma associação entre os genes BBS9 e GLIS3 e o outcome do doente. Sabe-se que pacientes com a síndrome Bardet-Biedl têm mutações no gene BBS9. A obesidade é uma das manifestações clínicas mais importantes desta síndrome e foi demonstrado que, após um AVC, os danos neurológicos e as lesões cerebrais são menores em ratinhos em regime de restrição calórica do que em ratinhos sem esta restrição, o que sugere que o excesso de calorias consumidas/obesidade poderá influenciar o outcome após AVC. Relativamente ao gene GLIS3, que codifica um factor de transcrição, tinham sido anteriormente reportadas associações deste gene com a diabetes. Esta doença é um factor de risco para o AVC e está também associada com maior risco de morte e incapacidade funcional de doentes quando o AVC ocorre. Apesar de não ser imediatamente perceptível qual o papel dos genes BBS9 e GLIS3 no outcome dos doentes, é possível que estes genes tenham uma influência indirecta nesse fenótipo através de um efeito na diabetes e obesidade. Em conclusão, os resultados obtidos durante este trabalho de doutoramento sugerem que tanto a susceptibilidade ao AVC como o outcome do doente são modulados por uma combinação de efeitos de genes independentes e de interacções entre genes. Isto indica que os mecanismos envolvidos na predisposição a esta doença e na recuperação posterior dos doentes poderão ser bastante complexos. É de salientar que, com este trabalho de doutoramento, o número de genes candidatos analisados, até ao momento, na área da genética do outcome praticamente duplicou. Além disso, pela primeira vez, foi realizado um estudo de associação ao nível de todo o genoma com o outcome do doente. No futuro, será desejável aumentar a dimensão da amostra, em especial dos doentes com informação sobre recuperação. Deverão, ainda, ser realizados estudos para identificar as variantes genéticas causais que estão na base das associações encontradas com a susceptibilidade ao AVC e com o outcome do doente.
