Author(s):
Domingues, Ana Inês Jones Manteigas, 1982- 
Date: 2011
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/4194
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Células endoteliais; VEGF; Biologia nuclear; Cicatrização de feridas; Regulação génica; Teses de doutoramento - 2011
Description
Tese de doutoramento, Biologia (Biologia Celular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011 The angiogenic growth of new blood vessels from pre-existing ones is fundamental during embryonic development and for normal homeostasis of adult tissues. Vascularization ensures the delivery of oxygen and nutrients essential for organ growth and repair. Under physiological conditions, a fine balance between stimulators and inhibitors regulates the complex process of angiogenesis. However, in pathological conditions as tumor progression, the stimulus becomes excessive and induces an angiogenic switch that results in the uncontrolled growth of blood vessels that facilitates tumor growth and metastasis. The VEGF/VEGFRs system is a potent regulator of the angiogenic response in endothelial cells (ECs). VEGF binds and activates its tyrosine kinase receptors VEGFR1 and VEGFR2 at the surface of ECs. In contrast to VEGFR1, VEGFR2 has a potent tyrosine kinase activity and is considered the major mediator of the signaling responses induced by VEGF. VEGFR2 phosphorylation at the cell membrane induces the activation of intracellular signaling cascades that regulate a wide range of biological responses including survival, proliferation, migration and permeability. The molecular bases of these processes have been the focus of intensive work for the last 40 years. Moreover, the discovery of the presence of VEGF and VEGFR2 not only at the cell surface but also intracellularly, in particular in the cell nucleus, has opened the possibility for new mechanisms of VEGF/VEGFR2 activity. In this work we focused on the molecular basis and relevance of the nuclear internalization of VEGF and VEGFR2 in ECs. We demonstrated that upon VEGF stimulation, both VEGF and VEGFR2 are internalized to the nucleus in a VEGFR1-mediated process required for EC recovery following in vitro wounding. We also showed that the VEGF/VEGFR2 internalization is mediated via caveolae-mediated endocytosis and microtubules and requires the activation of the PI3K pathway. By generating several VEGFR2 deletion mutants in tyrosine residues we demonstrated that VEGFR2 internalization required its phosphorylation. In addition, we showed the importance of the tyrosine residue Y951 for the nuclear internalization of VEGFR2. Having established the molecular basis for this nuclear internalization process, we focused on the role of VEGFR2 in the nucleus. We showed that VEGFR2 interacts with the Sp1 transcription factor. We also demonstrated that VEGFR2 binds to the Sp1-responsive region of the VEGFR2 proximal promoter and that the VEGFR2 binding to DNA is linked to the transcriptional activation of the VEGFR2 promoter. This previously unrecognized function of nuclear VEGFR2 as a putative transcription factor involved in the regulation of its own transcription is a novel mechanism for the amplification of the angiogenic response and can be crucial to develop new therapeutic approaches associated with angiogenesis-dependent diseases. O crescimento de vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes. Angiogénese é um processo fundamental durante o desenvolvimento embrionário e que contribui também para a homeostasia dos tecidos adultos. A vascularização assegura o fornecimento de oxigénio e nutrientes, essenciais para o crescimento e reparação dos órgãos. Todos os vasos sanguíneos são revestidos por uma monocamada de células endoteliais vasculares, considerada um componente essencial no processo angiogénico, uma vez que em resposta a diferentes estímulos, as células endoteliais migram e proliferam estabelecendo novos vasos sanguíneos. Em condições fisiológicas a angiogénese é regulada por um balanço crítico entre factores estimuladores (pró-angiogénicos) e inibidores (anti-angiogénicos). No entanto, em condições patológicas, como durante o crescimento tumoral, o excesso de moléculas estimuladoras induz o crescimento descontrolado de vasos sanguíneos facilitando a progressão tumoral e a disseminação de metástases. O factor de crescimento do endotélio vascular (VEGF) é um dos reguladores mais importantes da resposta angiogénica em células endoteliais vasculares. O VEGF é produzido pela maioria das células do organismo em resposta a diferentes estímulos como a hipoxia e actua maioritariamente nas células endoteliais vasculares promovendo a sobrevivência, proliferação e migração destas células. Os efeitos biológicos do VEGF são mediados por meio de dois diferentes receptores cinase de tirosina, específicos e expressos na superfície destas células: o receptor 1 e 2 designados por VEGFR1 (ou FLT1) e VEGFR2 (ou KDR). Estudos genéticos demonstraram que tanto o VEGF como os seus receptores são necessários para o desenvolvimento normal do sistema vascular. Os embriões de murganhos deficitários em qualquer um destes genes apresentam letalidade entre os dias E8.5-12.5 do desenvolvimento embrionário manifestando graves deficiências na formação inicial dos vasos sanguíneos. Diferentes estudos mostraram que apesar da afinidade do VEGF ser superior para VEGFR1 relativamente a VEGFR2, é a activação do segundo que é responsável pelos efeitos mediados pelo VEGF nas células endoteliais. O modo de acção do VEGF é classicamente descrito através da sua ligação ao domínio extracelular do VEGFR2, induzindo a sua dimerizaçao e a auto-fosforilaçao de resíduos de tirosina específicos no domínio intracelular do receptor. A fosforilaçao destes resíduos gera locais de ligação e activação de mensageiros secundários que induzem a activação de diferentes vias de transdução de sinal e consequentemente a respostas celulares específicas como a proliferação, migração, sobrevivência e permeabilidade. Os mecanismos moleculares de acção do VEGF e VEGFR2 têm sido alvo de numerosos estudos nos últimos 40 anos. Recentemente, diferentes publicações mostraram que para além da localização na superfície celular, o VEGF e VEGFR2 são também detectados no núcleo nomeadamente em tecidos e células leucémicas, in vitro e in vivo. Outros trabalhos mostraram a presença de VEGFR2 no núcleo de células endoteliais de rato ou bovino. Estas observações abriram, sem dúvida, a possibilidade de novos mecanismos de acção exercidos por estas moléculas. Assim, no decorrer deste trabalho focámo-nos na investigação dos mecanismos moleculares de internalização nuclear do VEGF e VEGFR2 nas células endoteliais humanas e na relevância funcional deste processo. Na primeira parte deste trabalho, demonstrámos que após um estímulo de VEGF, tanto o VEGF como o VEGFR2 são internalizados para o núcleo da célula endotelial, num processo dependente de VEGFR1. Verificámos que esta mesma internalização é necessária para a reconstituição de uma monocamada endotelial após a indução de feridas in vitro. Estes resultados revelaram uma nova função biológica já anteriormente descrita dos dois receptores de VEGF. Os nossos resultados mostraram também que no processo de internalização é necessária a activação da via de sinalização de PI3K, e que o mesmo envolve a endocitose mediada por caveolina-1, usando os microtúbulos como motores. Para além disto, através da construção de mutantes truncados em diferentes resíduos de tirosina na região intracelular do VEGFR2, demonstrámos que a fosforilação/activação do VEGFR2 é crucial para a translocação nuclear observada. Com o objectivo de identificar quais os resíduos de tirosina envolvidos na translocação do receptor, construímos várias proteínas de fusão VEGFR2-GFP usando o VEGFR2 nativo ou formas mutadas de VEGFR2; nestas um ou dois resíduos de tirosina foram convertidos em resíduos de fenilalanina e testámos a sua capacidade de serem internalizados para o núcleo de células endoteliais por ensaios de microscopia denominados Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). Os nossos resultados demonstraram que o resíduo de tirosina Y951 (localizado em um dos domínios intracelulares do receptor), tem uma função importante na translocação nuclear do VEGFR2. Na segunda parte deste trabalho focámo-nos na investigação da função do receptor VEGFR2 no núcleo das células endoteliais. Num modelo endotelial.de sobreexpressão de VEGFR2, os nossos resultados mostraram que a sobreexpressão nuclear de VEGFR2 estava correlacionada com a expressão ou actividade de várias proteínas nucleares. O envolvimento de VEGFR2 na actividade transcricional também foi sugerido em ensaios de incorporação de 5-FU, em que demonstrámos que os níveis de transcrição celulares estavam diminuídos e correlacionados com a diminuição dos níveis nucleares de VEGFR2. Por análise de espectrometria de massa os nossos resultados mostraram que em células endoteliais, o VEGFR2 nuclear interage com diferentes proteínas nucleares. Confirmámos a interacção de VEGFR2 com o factor de transcrição Sp1, envolvido na regulação de diferentes genes importantes para a resposta angiogénica. Através de ensaios de imunoprecipitaçao da cromatina (ChIP), mostrámos que o VEGFR2 se liga a uma região do seu próprio promotor e à qual também se liga Sp1. Estes resultados foram confirmados por ensaios de interacção DNA-proteína (EMSA), em que se utilizou a mesma região do promotor de VEGFR2. Contudo, os nossos resultados não permitem definir se VEGFR2 se liga ao seu promotor interagindo com Sp1. Verificámos ainda que a ligação de VEGFR2 ao seu promotor está associada à sua activação transcricional. Ensaios repórter usando luciferase, realizados em células 3T3 que permitiu-nos identificar a região entre -300/-116 (relativamente ao local de início da transcrição), como essencial para conferir a actividade transcricional dependente de VEGFR2. Para além destes resultados, e por meio de ensaios de ChIP, mostrámos que a ligação de VEGFR2 ao DNA é dependente da activação por VEGF, assim como a sua translocação nuclear. Por último e reforçando as observações acima descritas, verificámos também que a igação de VEGFR2 ao seu próprio promotor é bloqueada pelo tratamento com Bevacizumab ou Sunitinib, dois agentes anti-angiogénicos que inibem a activação de VEGFR2. O nosso trabalho revela uma nova função do VEGFR2, como um factor de transcrição envolvido na regulação da sua própria transcrição e sugere que este poderá estar implicado na regulação de outros genes importantes para a amplificação da resposta angiogénica. Diferentes estratégias terapêuticas têm vindo a ser desenvolvidas com o objectivo de bloquear a activação de VEGFR2, enquanto proteína membranar. Contudo, estes inibidores angiogénicos não são efectivos em todos os tumores e o benefício é modesto, mesmo para os doentes que inicialmente respondem de forma favorável à terapêutica, indicando que existem mecanismos de resistência à terapia anti- VEGF. A análise da actividade transcricional de VEGFR2 nestes tumores e a identificação de genes regulados por esta proteína irão certamente contribuir para uma maior compreensão da sua função na angiogénese tumoral e na descoberta de novos alvos terapêuticos.
