Author(s):
Alenquer, Marta Bebiano, 1980- 
Date: 2009
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/3940
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Gammaherpesvirinae; Latência viral; Linfócitos B; Herpesviridae; Teses de doutoramento - 2010
Description
Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Biopatológicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2010 The major biological characteristic of herpesviruses is their ability to establish life-long
latent infections in specific cell types within their host. In particular,
gammaherpesviruses typically colonise their hosts by driving the proliferation of
infected B cells in germinal centres (GCs) and establishing a lifelong reservoir of
latently infected memory B cells. These events are controlled by viral proteins that
subvert host cell signalling pathways by regulating or replacing functionally specific
signalling proteins. These viral proteins are of particular interest as they constitute key
components of gammaherpesvirus pathogenesis and a potential link to virus associatedoncogenic
transformation. One of such proteins is the latency-associated M2 protein of
murid herpesvirus-4 (MuHV-4). M2 has been shown to act as an adaptor molecule,
mediating the assembly of multiprotein complexes that favour the interaction between
enzymes and substrates, and thus mediate the modulation of B cell signalling pathways
downstream of the B cell receptor (BCR). The central aim of this research was to
determine at which stage of the MuHV-4 viral life cycle M2 is performing these
biochemical functions and how important they are for normal host colonization. To this
end, recombinant viruses with disruptive mutations in M2 domains, which are essential
for binding and modulating the activity of B cell signalling proteins, were engineered.
The ability of these recombinant viruses to establish and maintain a latent infection was
analysed upon intranasal infection of mice. Infection of mice with recombinant viruses
resulted in a delay in the seeding of splenic follicles and in the expansion of latency in
GC B cells. The role of M2 in MuHV-4 infection of other cell types, namely dendritic
cells and macrophages, was also assessed. No evidence was found supporting a function
for M2 in these cells. Overall, these studies reveal that M2 functions in vivo as a
modulator of B cell signalling pathways and that this crosstalk is critical in the process
of viral latency, for the efficient colonization of splenic follicles. A principal característica biológica dos herpesvírus é a sua capacidade de persistirem
durante toda a vida do hospedeiro através do estabelecimento de infecções latentes.
Durante a latência, os herpesvírus permanecem no núcleo da célula infectada sob a
forma de um episoma, não havendo produção de viriões infecciosos. A expressão génica
está limitada aos genes importantes para a manutenção do genoma viral e sobrevivência
da célula hospedeira, permitindo ao vírus não ser reconhecido pelo sistema imunitário.
No caso dos gama-herpesvírus, a fase de latência é estabelecida maioritariamente em
células B e está associada ao desenvolvimento de doenças linfoproliferativas, fazendo
com que o controlo destes vírus seja um objectivo clínico prioritário. Para persistirem
nos hospedeiros, os gama-herpesvírus exploram o ciclo de vida normal das células B,
induzindo a proliferação das células infectadas em centros germinativos e a sua
posterior diferenciação em células B de memória de longa duração. Estes processos são
controlados por proteínas virais que subvertem vias de sinalização da célula B ao
regularem ou substituírem determinadas proteínas sinalizadoras. Assim, o estudo das
proteínas modeladoras virais é de extrema importância, uma vez que estas têm um papel
fundamental na patogénese dos gama-herpesvírus e estão potencialmente relacionadas
com desenvolvimento de doenças linfoproliferativas. Os dois gama-herpesvírus
humanos conhecidos até à data – vírus Epstein-Barr (EBV) e o vírus associado ao
sarcoma de Kaposi (KSHV) – codificam proteínas membranares expressas durante a
fase de latência que actuam como receptores constitutivamente activos, interferindo
assim em vários aspectos da sinalização da célula B. Embora muitos estudos tenham
abordado a função bioquímica destas proteínas, a estrita especificidade de hospedeiro
dos gama-herpesvírus humanos tem limitado o estudo da função destas proteínas in
vivo. Assim, um dos maiores desafios no estudo dos gama-herpesvírus consiste em
relacionar a função bioquímica dos genes com o seu papel na infecção natural do
hospedeiro.
Neste estudo utilizou-se a infecção de ratinhos de laboratório com o herpesvírus de
murganho 4 (MuHV-4) como modelo experimental determinar, in vivo, a importância
que a modelação da função das células B tem para o estabelecimento e manutenção de
latência no hospedeiro. O MuHV-4 é um parasita natural de roedores selvagens,
geneticamente relacionado com os agentes patogénicos EBV e KSHV e, à semelhança
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destes, infecta latentemente células B, induzindo a sua proliferação em centros
germinativos. Este modelo animal tem, portanto, um grande potencial para a
compreensão de factores virais e do hospedeiro relevantes para a patogénese de gamaherpesvírus.
Estudos bioquímicos realizados no nosso grupo demonstraram que a
proteína M2 de MuHV-4 se encontra envolvida na modelação da função das células B.
No entanto, M2, contrariamente às proteínas modelação de EBV e KSHV, não se
comporta como um receptor celular constitutivamente activo, mas como uma proteína
adaptadora. As funções adaptadoras de M2 promovem a formação de complexos
celulares multi-proteicos que favorecem a aproximação entre enzimas e substratos,
modelando deste modo vias de sinalização da célula B. Uma das vias de sinalização
activadas por M2 é a via das proteínas Vav1/Rac1. M2, ao facilitar o encontro entre
Vav1 e a cinase de tirosinas Fyn, induz a fosforilação de Vav1 por Fyn e,
consequentemente, a activação da actividade catalítica de Vav1. Estudos recentes
demonstraram que M2 está também envolvida na interacção e modulação da actividade
de outras proteínas sinalizadoras, nomeadamente PI3K e PLCγ2.
O presente estudo teve como principal objectivo relacionar a função molecular de M2,
enquanto modeladora de vias de sinalização de células B, com o seu papel na infecção
in vivo do hospedeiro. Para tal, construíram-se vírus recombinantes nos quais domínios
de M2 importantes para a sua função molecular foram inactivados através de mutações
pontuais. Inicialmente, construíram-se vírus recombinantes que contêm mutações na
região rica em prolinas (M2P2) ou em dois resíduos de tirosina susceptíveis de
fosforilação por Fyn (M2Y). Estes dois domínios foram identificados em estudos
bioquímicos realizados pelo nosso grupo como sendo essenciais para a ligação e
activação de Vav1. Para avaliar a importância biológica destes domínios procedeu-se à
infecção intranasal de ratinhos com os vírus recombinantes e analisou-se o
comportamento dos vírus durante a fase de infecção latente, por comparação com a
infecção de ratinhos com o vírus selvagem (WT) ou o vírus M2FS, que não expressa a
proteína M2. Os vírus foram caracterizados durante o estabelecimento e manutenção da
fase de latência através de três ensaios independentes mas complementares. Através de
ensaios de reactivação ex vivo avaliou-se a infecção latente em esplenócitos totais. A
frequência de infecção em células B do centro germinativo, que constituem o principal
reservatório de latência do vírus, foi determinada após purificação desta população por
citometria de fluxo, combinando ensaios de diluição limite com PCR em tempo real. A
realização de experiências de hibridação in situ em secções do baço permitiu localizar
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as células infectadas e monitorizar a sua cinética de proliferação no interior dos
folículos linfóides. Os resultados obtidos pelos três ensaios foram concordantes entre si
e revelaram que os domínios funcionais de M2 analisados são fundamentais, durante o
estabelecimento de latência, para uma eficiente colonização dos folículos linfóides e
estabelecimento de reacções do centro germinativo. Além disso, o fenótipo apresentado
pelos vírus recombinantes com mutações pontuais em M2 durante o estabelecimento de
latência é indistinguível do fenótipo obtido com o vírus que não expressa M2. Este facto
vem reforçar a importância fisiológica, na infecção latente de MuHV-4 em células B, da
modulação de vias de sinalização da célula B por M2.
A eliminação da expressão de M2 durante a fase de latência em ratinhos BALB/c
origina dois fenótipos distintos: por um lado, durante o estabelecimento de latência,
origina um atraso na colonização dos folículos e no início da proliferação das células
infectadas nos centros germinativos; por outro lado, a longos tempos pós-infecção,
observa-se um aumento exacerbado do número de células B do centro germinativo
infectadas. Apesar da disrupção dos domínios funcionais de M2 reproduzir totalmente o
comportamento do vírus que não expressa M2 durante o estabelecimento de latência, o
fenótipo a longo prazo não é reproduzido. Assim, a longos tempos pós-infecção, os
vírus recombinantes com mutações nos domínios funcionais de M2 comportam-se
exactamente como o vírus WT. Estudos recentes realizados no nosso laboratório
revelaram que esta incapacidade do vírus que não expressa M2 em cessar a proliferação
das células do centro germinativo, não se deve a uma função molecular de M2 mas sim
a um efeito imunológico. A proteína M2 contém um epítopo que é activamente
reconhecido por células T citotóxicas (CTLs) e contribui para o controlo da infecção
latente de MuHV-4. Na ausência do epítopo de M2, as células T citotóxicas não
reconhecem as células infectadas e não conseguem controlar a amplificação da latência
em células B do centro germinativo.
Para verificar se todas as funções moleculares de M2 importantes para o
estabelecimento de latência em células B tinham sido identificadas, construiu-se um
vírus recombinante duplo, com mutações pontuais não só nos resíduos de tirosina de
M2 mas também no seu epítopo. O fenótipo deste vírus foi analisado após infecção de
ratinhos e comparado com o do vírus deficiente para a expressão de M2. O
comportamento dos dois vírus foi exactamente o mesmo, tanto durante estabelecimento
de latência como na infecção a longo prazo. Esta observação indica que os domínios de
M2 importantes para o estabelecimento e manutenção da latência foram identificados:
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através das tirosinas e da região rica em prolinas, M2 modula vias de sinalização da
célula B de forma a promover uma eficiente colonização dos folículos linfóides; o
epítopo reconhecido por CTLs torna M2 indirectamente responsável pelo nível de carga
viral a longo prazo.
Estudos bioquímicos recentes realizados no nosso laboratório demonstraram que os dois
resíduos de tirosina fosforilados de M2 (Y120 e Y129) têm especificidades diferentes,
ligando-se a moléculas sinalizadoras distintas. Além disso, a tirosina 120 parece ter um
papel predominante, sendo essencial na ligação a Vav1, Fyn, PLCγ2 e PI3K. Para
determinar a importância relativa das duas tirosinas durante a infecção in vivo de
ratinhos, construíram-se novos vírus recombinantes com cada uma das tirosinas
individualmente mutadas. Os resultados obtidos demonstraram que embora in vitro a
tirosina 120 pareça ser mais importante na interacção com moléculas sinalizadoras, in
vivo ambas as tirosinas são necessárias para o normal estabelecimento de latência. Este
resultado sugere que a tirosina 129 interage com outras moléculas importantes para a
modelação da função da célula B.
Embora o alvo preferencial para o estabelecimento de latência de MuHV-4 sejam as
células B, durante o estabelecimento da fase latente este vírus é também capaz de
infectar células dendríticas e macrófagos. Assim, no presente trabalho pretendeu-se
ainda avaliar a importância da função de M2 na infecção de células dendríticas e
macrófagos. Para tal, infectaram-se culturas de células dendríticas ou de macrófagos
com o vírus deficiente para expressão de M2 ou com o vírus WT e avaliou-se o
estabelecimento de infecções líticas e latentes por imunofluorescência. Além disso,
infectaram-se ratinhos com os mesmos vírus e analisou-se a infecção de células
dendríticas e macrófagos dos nódulos linfáticos mediastinais pouco tempo após a
infecção. Em ambos os casos não foram detectadas diferenças na infecção entre o vírus
WT e o mutante deficiente para a expressão de M2, o que indica que M2 não parece
desempenhar qualquer função molecular importante na infecção de células dendríticas e
macrófagos.
Em conclusão, este trabalho demonstrou que M2 funciona in vivo como uma proteína
moduladora de vias de sinalização de células B e que esta função é fundamental na
patogénese de MuHV-4, para uma eficiente colonização dos folículos linfóides durante
o estabelecimento de latência.
