Description
Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2011 This project presents a comprehensive approach to the identification of new genes that
influence the risk for developing stroke. Stroke is the leading cause of death in Portugal and the third
leading cause of death in the developed world. It is even more disabling than lethal, and the persistent
neurological impairment and physical disability caused by stroke have a very high socioeconomic
cost. Moreover, the number of affected individuals is expected to increase with the current aging of the
population. Stroke is a “brain attack” cutting off vital blood and oxygen to the brain cells and it is a
complex disease resulting from environmental and genetic factors. Major known risk factors include
family history, age, hypertension, hypercholesterolemia, diabetes, cardiovascular disease, smoking and
alcohol consumption. The common forms of stroke can be classified in two major clinical types:
ischemic stroke (IS; most frequent) or hemorrhagic (10-20% of cases) stroke. Identification of genes
increasing susceptibility to stroke could have far-reaching public health impact. The genetic
component of this disease has been demonstrated in twin, family and animal model studies, and
mutations have been found in several genes in rare classical Mendelian forms of stroke. However,
very few susceptibility genes for the common forms of stroke have been identified and association
studies have mostly reported conflicting results.
In this project, to accomplish our goals in the study of IS, we first performed some candidate
gene association analysis. Concomitantly, we applied the genomic convergence (GC) approach
combining whole genome linkage screens, expression analysis, and case-control association studies.
This unified, comprehensive, and multidisciplinary approach has not yet been implemented in other
studies of stroke but the availability of new genetic, molecular and statistical tools, as well as their
success in the study of other complex diseases, made such an approach both timely and essential.
Since phosphodiesterase 4D (PDE4D) and arachidonate 5-lipoxygenase-activating protein
(ALOX5AP) genes have been in recent years controversially implicated in the risk of IS, we assessed
their association with IS in a Portuguese cohort. PDE4D degrades second messenger cyclic adenosine
monophosphate, a key signal transduction molecule in different cell types, including inflammatory,
vascular endothelial and smooth muscle cells. ALOX5AP is involved in the initial steps of leukotriene
synthesis and is secreted by various types of inflammatory cells clustering at the injured sites in blood
vessels. We genotyped 67 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the 5’end of PDE4D and 24
SNPs in ALOX5AP and both 10kb flanking regions on 565 Caucasian Portuguese patients and 518
unrelated controls. These SNPs are either tagging SNPs from HapMap or SNPs previously found
associated. We tested their allelic, genotype and haplotype associations with IS risk, using standard
qui-square tests (χ2) and multivariate logistic regression to adjust the analyses of association with risk
for confounding factors, namely hypertension, diabetes and ever smoking. None of the previously
associated SNPs were found associated with IS risk in our cohort, and considering the number of tests
performed, we found no major involvement of other variants in these genes in stroke susceptibility in the Portuguese population. Only the SNP rs7442640 in PDE4D shows an association (p-value =
0.006) with IS risk when genotypic tests were adjusted for covariates, and SNP rs4491352
downstream of the ALOX5AP shows a modest evidence of association with IS risk (0.017< p-value <
0.025) for allelic and unadjusted genotypic tests. Performing a meta-analysis including all recently
published studies and our Portugese and Spanish samples for SNP41, SNP45, SNP56, SNP87, and
SNP89 (found associated in the original report) in PDE4D, no significant association results with IS
risk were found. However, we found that SNP rs10507391 (or SG13S114) in ALOX5AP, which is part
of the HapA haplotype, was associated with IS risk as described in the original study both in the
Iberian population and in the meta-analysis performed. These results suggest that PDE4D may not
constitute a major risk factor for IS in the Portuguese or Spanish populations, contrasting with
ALOX5AP which may confer an increased risk of IS in the Iberian and other populations.
We also assessed the association of the kalirin gene (KALRN) with IS in our Portuguese cohort
since several recent studies have implicated its variants with susceptibility to cardiovascular and
metabolic phenotypes, but no studies have yet been performed in stroke. Cerebrovascular and
cardiovascular diseases are both complex disorders resulting from the interplay of genetic and
environmental factors, and may share several susceptibility genes. KALRN is involved, among others,
in the inhibition of inducible nitric oxide synthase, in the regulation of ischemic signal transduction,
and in neuronal morphogenesis, plasticity and stability. Our goal was to determine whether SNPs in
the KALRN region on 3q13, which includes the ropporin gene (ROPN1), predispose to IS in our cohort
of Portuguese patients and controls. We genotyped 34 tagging SNPs in the KALRN and ROPN1
chromosomal region on 565 IS patients and 517 unrelated controls from our Portuguese case-control
sample, and performed genotype imputation for 405 markers on chromosome 3. We tested the singlemarker
and haplotype association of these SNPs with IS as explained above. One SNP in the ROPN1-
KALRN intergenic region (rs4499545) and two SNPs in KALRN (rs17286604 and rs11712619) showed
significant (0.003 < p-value < 0.049) allelic and genotypic (unadjusted and adjusted for hypertension,
diabetes and ever smoking) association with IS risk. Thirty-two imputed SNPs also showed an
association at p-value < 0.05, and actual genotyping of three of these polymorphisms (rs7620580,
rs6438833 and rs11712039) validated their association. Furthermore, rs11712039 was associated with
IS (0.001 < p-value < 0.01) in the genome-wide association study (GWAS) published by Ikram and
co-authors (2009). These studies suggest that variants in the KALRN constitute risk factors for IS, and
that KALRN may be a common genetic risk factor for vascular diseases.
Additionally, we tested the association with the IS risk of the complement inhibitor factor H
gene (CFH), as well as of several candidate genes related to neuroprotection: erythropoietin (EPO),
heme-oxigenase 2 (HO2), and kallikrein 1 (KLK1) genes. CFH has been suggested to play an
important role in the complement inhibition in atherosclerotic lesions and has been consistently
associated with an increased risk for age-related macular degeneration (AMD) and myocardial
infarction (MI) which share several risk factors with stroke. On the other hand, EPO, HO2 and KLK1
are neuroprotectors, for instance, in brain hypoxia and ischemia (EPO) and against induced stroke (KLK1). The polymorphism in CFH (rs1061170) previously associated with AMD and MI seems to be
modestly associated (388 Portuguese patients and 461 controls; 0.030 < p-value < 0.035) with the IS
risk in allelic and unadjusted genotypic tests, but no haplotype tagging SNP in this gene was clearly
associated with IS in the GWAS performed by Ikram et al. (2009). Although we only study one
polymorphism in the gene, these results did not justify a more in depth analysis. We genotyped 3, 3
and 5 tagging SNPs in the coding and 10 kb flanking regions of the EPO, HO2 and KLK1,
respectively, on 565 IS patients and 518 controls from our Portuguese sample. No single-marker and
haplotype associations were found for the studied SNPs in these neuroprotector genes, suggesting that
they do not constitute genetic risk factors of IS.
To identify novel susceptibility genes for IS, we applied the proposed GC approach. We
performed gene expression analysis in peripheral blood mononuclear cells of 20 IS cases and 20 ageand
sex-matched controls using Affymetrix GeneChip Human U133 Plus 2.0 arrays, which represent
47,000 human transcripts and variants. We identified several affected biological pathways in stroke
patients, such as the cell adhesion molecules pathway. 16 out of the differentially expressed genes
among cases and controls (1.2 fold-change cut-off and uncorrected p-value < 0.05) map to linkage
peaks reported in published human whole-genome linkage studies. All tagging SNPs from these
prioritized genes and from their 10 kb flanking regions (a total of 191 SNPs) were genotyped in 565 IS
cases and 520 controls from our Portuguese biobank. Single-marker and haplotype association tests
were performed. Association results suggest that variants in 6 (HEMGN, GFI1B, TMTC4, TTC7B,
SDC4 and TUBB1) out of the 16 prioritized genes may constitute risk factors for IS in the Portuguese
population. Several of the associated SNPs in these genes are also part of associated haplotypes. SNPs
like the intronic rs9582406 and rs946845 polymorphisms in TMTC4, and the intronic rs2284278 in
SDC4, were associated (0.015 < p-value < 0.050) with IS risk in all tests performed. On the other
hand, the intronic SNP rs1535321 in TTC7B showed an association (p-value = 0.009) in allelic and
unadjusted genotypic tests, even though no association in the adjusted test for hypertension, diabetes
and ever smoking was verified.
To follow-up these results, SNPs with single low-stringency significance association (p-value
< 0.05) in at least one of the tests performed, and some SNPs that define associated haplotypes, were
then genotyped in a Spanish dataset. A total of 570 Caucasian IS cases and 390 controls were
included, and allelic, genotype and haplotype association tests with IS risk were conducted using also
χ2 tests and multivariate logistic regression to adjust the analyses for hypertension, diabetes,
dyslipidemic status and cigarette smoking. The same analyses were performed for the
atherothrombotic, cardioembolic and lacunar forms of stroke. We found some significant associations
with IS risk in TMTC4, TTC7B and SDC4, however, the only replicated SNP was rs9582406 in
TMTC4 which was associated with IS risk in unadjusted tests (p-value = 0.019) in the Spanish casecontrol
dataset. This SNP is also associated with the risk of atherothrombotic and lacunar forms of
stroke for allelic and genotypic tests (0.011 < p-value < 0.049). For TTC7B and SDC4, the single SNPs and haplotypes associated in the Spanish sample were not the same as in the Portuguese cohort. The
SNP rs6073708 in SDC4 was associated in the Spanish dataset for all tests performed (0.027 < p-value
< 0.029). However, none of the studied SNPs were clearly replicated in the recent well-powered
GWAS reported by Ikram and colleagues (2009).
The overall results suggest that HEMGN and GFI1B (that were not replicated in the Spanish
dataset) may constitute risk factors for IS in the Portuguese population, being important the
enlargement of the Portuguese sample to validate the positive results. Similarly, TUBB1, which could
not be genotyped in the Spanish cohort for technical problems, may constitute a risk factor for IS in
the Portuguese population but should be further studied in other datasets to validate and understand its
role in IS. TMTC4 may constitute a risk factor for IS in the Iberian population, and TTC7B and SDC4,
with the observed heterogeneity of their significant association results among cohorts, may be novel
risk factors for IS, being likely that their true susceptibility variants have not been studied yet. TTC7B
was one of the top hits for major cardiovascular diseases in the Framingham Heart Study 100K project
GWAS (Larson et al. 2007). For this gene, several SNPs and haplotypes in the intron 5 – intron 6
region associated in the Portuguese and Spanish datasets individually and combined, were modestly
associated in the GWAS reported by Ikram and colleagues (2009). Multiple independent lines of
evidence therefore support the role of TTC7B in stroke susceptibility, but further work is warranted to
pinpoint the exact risk variant and to elucidate its pathogenic potential.
In this project, given the very large number of SNPs tested, none of the significant findings
would survive to multiple testing correction. However, it is generally accepted that replication in
multiple independent datasets remains the gold-standard of association studies, even for modest
associations. If our findings could be confirmed in other independent datasets and a most complete
study of other possible genetic variants in the loci of interest could be performed, we think that
functional studies of the genes and of their causative variants will allow a significant improvement of
our knowledge on stroke disease. Deep sequencing may have to be used to precisely identify the true
susceptibility genetic variants, or rare variants that the association studies have no power to detect.
We suggest that identifying the genetic determinants of stroke using different strategies and
populations and analysing them in an integrate view as performed in this project, is a most complete
form to study the stroke in order to improve our knowledge of the disease. Este projecto apresenta uma abordagem multifactorial para a identificação de novos genes que
influenciem o risco de sofrer acidentes vasculares cerebrais (AVCs). Os AVCs são a principal causa de
morte em Portugal e a terceira maior causa de morte no conjunto dos países desenvolvidos. São ainda mais
incapacitantes do que letais e os distúrbios neurológicos persistentes e a incapacidade física que provocam
têm um custo socioeconómico muito elevado. Além disso, o número de pessoas afectadas deverá aumentar
com o actual envelhecimento da população. Os AVCs são um “ataque cerebral” que interrompe o fluxo de
sangue e oxigénio para as células de determinadas regiões do cérebro e são uma doença complexa resultante
de factores genéticos e ambientais. Os principais factores de risco conhecidos incluem a idade, hipertensão,
hipercolesterolemia, diabetes, doenças cardiovasculares, consumo de tabaco e de álcool e história familiar.
As formas mais comuns dos AVCs podem ser classificadas em dois grandes tipos clínicos: AVCs isquémicos
(AVCI; mais frequentes), ou hemorrágicos (10-20% dos casos). A identificação de novos genes que
aumentem a susceptibilidade para se sofrer AVCs pode ter um forte impacto na saúde pública. A
componente genética da doença tem sido demonstrada em estudos feitos em gémeos, famílias e modelos
animais, e foram encontradas mutações em diversos genes em formas mendelianas raras de AVCs. No
entanto, poucos genes de susceptibilidade para as formas comuns de AVCs foram até hoje identificados e os
estudos de associação realizados apresentam geralmente resultados contraditórios.
Neste projecto, para atingir os objectivos propostos no estudo dos AVCIs, começaram por realizar-se
estudos de associação em alguns genes candidatos. Em paralelo, foi aplicada a abordagem de convergência
genómica (CG) que combina estudos de ligação em todo o genoma, análises de expressão génica e estudos
de associação em casos-controlos. Esta abordagem unificada, abrangente e multidisciplinar foi pela primeira
vez implementada no estudo de AVCs. A disponibilidade de novas ferramentas genéticas, moleculares e
estatísticas, bem como o seu sucesso no estudo de outras doenças complexas, tornam esta nova abordagem
oportuna e essencial.
Uma vez que os genes que codificam a fosfodiesterase 4D (PDE4D) e a proteína activadora de
araquidonato 5-lipoxigenase (ALOX5AP) têm sido nos últimos anos controversamente implicados com o
risco de sofrer AVCIs, avaliou-se neste projecto a sua associação com os AVCIs na nossa amostra
portuguesa. A proteína PDE4D degrada o segundo mensageiro adenosina monofosfato cíclica, uma molécula
de transdução de sinal chave em diferentes tipos de células inflamatórias, vasculares endoteliais e musculares
lisas. A proteína ALOX5AP está envolvida nos passos iniciais da síntese de leucotrienos e é secretada por
vários tipos de células inflamatórias aglomeradas em locais lesados de vasos sanguíneos. Foram genotipados
67 polimorfismos de um só nucleótido (SNPs) na extremidade 5' do gene PDE4D e 24 SNPs localizados no
gene ALOX5AP e ambas regiões flanqueadoras de 10kb, em 565 pacientes caucasianos portugueses e 518
controlos independentes. Os SNPs seleccionados são tagging SNPs do projecto HapMap ou SNPs que foram
encontrados previamente associados. Testaram-se as associações dos seus alelos, genótipos e haplótipos com
o risco sofrer AVCIs, utilizando testes padrão do qui-quadrado (χ2) e regressões logísticas com múltiplas
variáveis para ajustar as análises de associação com o risco para outros factores conhecidos, como a hipertensão, diabetes e consumo de tabaco. Nenhum dos SNPs previamente associados foram replicados na
nossa amostra, e considerando o número de testes realizados, não foi encontrada nenhuma associação
significativa de outras variantes destes genes na susceptibilidade para sofrer AVCs na população portuguesa.
Apenas o SNP rs7442640 do gene PDE4D se encontra associado (p-value = 0,006) com o risco de sofrer
AVCIs nos testes genotípicos ajustados para covariáveis e o SNP rs4491352 a jusante do gene ALOX5AP
apresenta uma associação moderada (0,017 < p-value < 0,025) para os testes alélicos e genotípicos não
ajustados. Realizando uma meta-análise incluindo todos os estudos publicados recentemente e as nossas
amostras portuguesas e espanholas para os SNP41, SNP45, SNP56, SNP87 e SNP89 (que se encontram
associados na publicação original) do gene PDE4D, não foram encontrados resultados de associação com o
risco de sofrer AVCIs. No entanto, verificou-se que o SNP rs10507391 (ou SG13S114) do gene ALOX5AP,
que faz parte do haplótipo HapA, está associado com o risco de sofrer AVCIs tal como descrito no seu
estudo original, tanto na população ibérica, como na meta-análise realizada. Estes resultados sugerem que o
gene PDE4D pode não ser o principal factor de risco para os AVCIs nas populações portuguesa e espanhola,
contrastando com o gene ALOX5AP que pode conferir um risco aumentado para se sofrerem AVCIs na
Península Ibérica e outras populações.
Avaliou-se também a associação do gene kalirin (KALRN) com os AVCIs na nossa amostra
portuguesa uma vez que vários estudos recentes têm implicado algumas das suas variantes com a
susceptibilidade para fenótipos cardiovasculares e metabólicos, mas nenhum estudo foi ainda realizado em
AVCs. As doenças cerebrovasculares e cardiovasculares são ambas complexas, resultantes da interacção de
factores genéticos e ambientais, e podem partilhar diversos genes de susceptibilidade. A proteína KALRN
está envolvida, entre outras funções, na inibição da enzima óxido nítrico sintase induzida, na regulação da
transdução de sinais de isquémia, e na morfogénese neuronal, plasticidade e estabilidade. O nosso objectivo
foi verificar se SNPs na região do gene KALRN, no cromossoma 3q13, que inclui o gene roporina (ROPN1),
predispõem para os AVCIs na nossa amostra de pacientes e controlos portugueses. Foram genotipados 34
tagging SNPs na região cromossómica dos genes KALRN e ROPN1, em 565 pacientes com AVCIs e 517
controlos, e realizada a imputação de genótipos para 405 marcadores no cromossoma 3. Testaram-se as
associações de cada SNP individualmente e dos haplótipos que constituem com os AVCIs. Um SNP na
região intergénica ROPN1-KALRN (rs4499545) e dois SNPs no gene KALRN (rs17286604 e rs11712619)
apresentam associações alélicas e genotípicas (não ajustadas e ajustadas para hipertensão, diabetes e
consumo de tabaco) significativas (0,003 < p-value < 0,049) com o risco de sofrer AVCIs. Trinta e dois
SNPs imputados encontram-se também associados com valores de p-value < 0,05, tendo sido validada a
associação de três destes polimorfismos (rs7620580, rs6438833 e rs11712039) por genotipagem. Além disso,
o SNP rs11712039 foi também associado com os AVCIs (0,001 <p-value <0,01) no estudo de associação em
todo o genoma (GWAS) publicado por Ikram e seus co-autores (2009). Esses resultados sugerem que
variantes no gene KALRN constituem factores de risco para os AVCIs, podendo ser factores de risco
genéticos comuns das doenças vasculares.
Foi também testada a associação com o risco de sofrer AVCs do factor H inibidor do complemento
(CFH), bem como de vários genes candidatos relacionados com mecanismos de neuroprotecção:
eritropoietina (EPO), hemoxigenase-2 (HO2) e calicreína 1 (KLK1). Tem sido sugerido que a proteína CFH desempenha um papel importante na inibição do complemento em lesões ateroscleróticas. Tem sido
consistentemente associada com um risco aumentado para a degeneração macular relacionada à idade
(AMD) e para os enfartes do miocárdio (MI) que compartilham vários factores de risco com os AVCs. Por
outro lado, as proteínas EPO, HO2 e KLK1 são neuroprotetoras, por exemplo, em casos de hipóxia cerebral e
isquémia (EPO) e contra acidente vascular cerebrais induzidos (KLK1). O polimorfismo no gene CFH
(rs1061170) que foi previamente associado com a AMD e os MI parece estar modestamente associado (388
pacientes e 461 controlos portugueses; 0,030 < p-value <0,035) com o risco de sofrer AVCIs nos testes
alélicos e genotípicos não ajustados, mas nenhum tagging SNP neste gene foi claramente associado com
AVCIs no GWAS realizado por Ikram et al. (2009). Apesar de só ter sido estudado um SNP neste gene, estes
resultados não justificam uma análise mais aprofundada. Foram genotipados 3, 3 e 5 tagging SNPs
localizados nas regiões codificantes e regiões flanqueadoras de 10 kb dos genes EPO, HO2 e KLK1,
respectivamente, em 565 pacientes com AVCIs e 518 controlos da nossa amostra portuguesa. Não foram
encontradas associações para nenhum marcador individualmente nem para haplótipos nestes genes
neuroprotetores, sugerindo que eles não constituem factores de risco genéticos para AVCIs.
Para identificar novos genes de susceptibilidade para AVCIs, aplicou-se ainda a abordagem de CG
proposta. Foram realizadas análises de expressão génica em células brancas mononucleares do sangue
periférico de 20 casos com AVCIs e 20 controlos equilibrados para a idade e para o género, usando
Affymetrix GeneChip Humam U133 Plus 2.0 arrays, que representam 47.000 transcritos humanos e
variantes. Foram identificadas várias vias metabólicas afectadas nos pacientes com AVCIs, tal como a via
das moléculas de adesão celular. 16 dos genes diferencialmente expressos entre casos e controlos (para um
cut-off de 1,2 fold-change e p-values não corrigidos < 0,05) encontram-se localizados em picos de ligação
descritos em estudos de ligação do inteiro genoma em humanos. Todos os tagging SNPs desses genes e das
suas regiões flanqueadoras de 10 kb (um total de 191 SNPs) foram genotipados em 565 casos com AVCIs e
520 controlos do nosso biobanco português. Foram realizados testes de associação de cada SNP
individualmente e dos haplótipos que constituem. Os resultados de associação sugerem que existem variantes
em 6 (HEMGN, GFI1B, TMTC4, TTC7B, SDC4 e TUBB1) dos 16 genes priorizados que podem constituir
factores de risco para os AVCIs na população portuguesa. Vários dos SNPs associados nestes genes também
fazem parte dos haplótipos que se encontraram associados. SNPs intrónicos como os rs9582406 e rs946845
do gene TMTC4, e o rs2284278 do gene SDC4, apresentam associação (0,015 < p-value < 0,050) com risco
de sofrer AVCIs em todos os testes realizados. Por outro lado, o SNP intrónico rs1535321 do gene TTC7B
encontra-se associado (p-value = 0,009) nos testes alélicos e genotípicos não ajustados, embora não
apresente associação no teste ajustado para hipertensão, diabetes e para o consumo de tabaco.
Para a replicação destes resultados, os SNPs que foram encontrados associados com p-value < 0,05
em pelo menos um dos testes realizados, assim como alguns SNPs que definem os haplótipos associados,
foram genotipados numa amostra espanhola. Um total de 570 casos caucasianos com AVCIs e 390 controlos
foram incluídos e foram realizados testes de associação dos seus alelos, genótipos e haplótipos com o risco
de sofrer AVCIs, utilizando também testes de χ2 e análises de regressão logística de múltiplas variáveis para
ajustar as análises feitas para a hipertensão, diabetes, dislipidemia e para o consumo de tabaco. As mesmas análises foram realizadas para os subtipos de AVCs aterotrombótico, cardioembolico e lacunar.
Encontraram-se algumas associações significativas com o risco de sofrer AVCIs nos genes TMTC4, TTC7B e
SDC4, no entanto, o único SNP replicado na amostra de casos-controlos espanhola foi o rs9582406 do gene
TMTC4, significativamente associado nos testes não ajustados (p-value = 0,019). Este SNP está também
associado com o risco para os subtipos aterotrombótico e lacunar de AVCs para os testes alélicos e
genotípicos (0,011 < p-value < 0,049). Para os genes TTC7B e SDC4, os SNPs e os haplótipos associados na
amostra espanhola não foram os mesmos que na portuguesa. O SNP rs6073708 do gene SDC4 foi associado
para todos os testes realizados (0,027 < p-value < 0,029). Nenhum dos SNPs estudados foi claramente
replicado GWAS publicado recentemente por Ikram e seus colaboradores (2009).
Globalmente, os resultados obtidos sugerem que os genes HEMGN e GFI1B (que não foram
replicados na amostra espanhola) podem constituir factores de risco para AVCIs na população portuguesa,
sendo importante o alargamento da amostra portuguesa para validação dos resultados. Da mesma forma, o
gene TUBB1, que não foi genotipado na amostra espanhola por problemas técnicos, pode constituir um factor
de risco para AVCIs na população portuguesa, mas deve ser ainda estudado noutras amostras para validar e
compreender o seu papel. Por outro lado, o gene TMTC4 pode constituir um factor de risco para os AVCIs na
população ibérica, e os genes TTC7B e SDC4, com a heterogeneidade observada nos seus resultados de
associação entre diferentes amostras, podem ser factores de risco para ACVIs, sendo provável que as suas
verdadeiras variantes de susceptibilidade não tenham sido estudadas ainda. O gene TTC7B foi um dos mais
associados para as principais doenças cardiovasculares no GWAS do projecto Framingham Heart Study
100K (Larson et al. 2007). Para este gene, vários SNPs e haplótipos na região intrão 5 - intrão 6 associados
nas amostras portuguesa e espanhola, encontram-se modestamente associados no GWAS publicado por
Ikram e seus colaboradores (2009). Existem portanto várias linhas de evidência independentes que apoiam a
importância do gene TTC7B na susceptibilidade dos AVCs, embora futuros trabalhos sejam necessários para
identificar variantes de risco exatas e para elucidar o seu potencial patogénico.
Neste projecto, dado o grande número de SNPs testados, nenhum dos resultados significativos
obtidos sobrevive à correcção para múltiplos testes. No entanto, é geralmente aceite que a replicação em
múltiplas amostras independentes continua a ser a melhor estratégia para os estudos de associação, mesmo
para associações modestas. Se os resultados apresentados puderem ser confirmados noutras amostras
independentes e um estudo mais completo de outras possíveis variações genéticas nos loci de interesse forem
ser realizados, pensamos que estudos funcionais dos genes e das suas variantes de susceptibilidade,
permitirão uma melhoria significativa do nosso conhecimento sobre AVCs. Pode recorrer-se à sequenciação
de nova geração para identificar com precisão as verdadeiras variantes de susceptibilidade, ou variantes raras
que os estudos de associação não tenham poder para detectar.
É sugerido que a identificação dos determinantes genéticos dos AVCs utilizando diferentes estratégias e
populações, e a sua analise de uma forma integrada, como a realizada neste projecto, é a forma mais
completa para o seu estudo, a fim de melhorar o conhecimento da doença.
