Autor(es):
Barroso, Marta Maria Seixas, 1987- 
Data: 2010
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/3057
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Microbiologia; Tuberculose; Fluorimetria; Biologia molecular; Teses de mestrado - 2010
Descrição
Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada).Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010 A tuberculose (TB) continua a representar um enorme problema de saúde pública, causando anualmente a morte de cerca de 3 milhões de pessoas. A antibioterapia disponível falha, devido ao desenvolvimento de resistências genéticas e, para agravar a situação não existe, actualmente, um sistema de vacinação eficaz. Este trabalho teve como objectivo o estabelecimento de um ensaio fluorimétrico para a medição rápida e em larga escala, da sobrevivência/morte intracelular de Mycobacterium spp., incluindo M. tuberculosis, em macrófagos, utilizando repórteres fluorescentes distintos para as bactérias e macrófagos. Os nossos resultados mostraram que a quantificação fluorimétrica de micobactérias que exprimem a proteína verde fluorescente GFP permite avaliar a sobrevivência em macrófagos infectados de forma semelhante ao método standard de contagem de unidades formadoras de colónias (UFC). Este método apresenta-se como uma alternativa rápida, menos laboriosa e dispendiosa ao método tradicional de contagem de UFC e, como tal, adequada à realização de rastreios em larga escala. Constituirá assim, certamente, uma ferramenta vantajosa para o rastreio de novos agentes terapêuticos, assim como para a procura de potenciais alvos terapêuticos, tanto ao nível do hospedeiro como da bactéria. Para a aplicação do método é necessário a utilização de um controlo positivo da morte intracelular bacteriana, tendo-se testado o efeito do lipopolissacárido (LPS), potente activador de macrófagos previamente descrito na literatura. Surpreendentemente, os nossos resultados revelaram que, na infecção por M. smegmatis o tratamento dos macrófagos com LPS durante a noite resulta num aumento da sobrevivência intracelular ao contrário do esperado efeito bactericida. Demonstrou-se que este efeito parece estar relacionado com um atraso da maturação do fagossoma e não numa redução de libertação de radicais livres. Tuberculosis remains one of the most significant Public Health issues causing around 3 million deaths annually. Due to the increase of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis, the available antibiotics fail in the treatment of the disease and there is still no effective prophylactic vaccine. This work aims to establish a fluorimetric assay for a rapid and high-throughput measurement of intracellular survival/death of Mycobacterium spp., including M. tuberculosis, in macrophages using fluorescent reporters for both the bacteria and macrophages. Our results show that fluorimetric quantification of GFP-expressing mycobacteria allows the analysis of survival inside infected macrophages in a similar manner to the standard method of counting colony-forming units (CFU). This method constitutes a faster, cheaper and less laborious alternative to the traditional CFU method and suitable for high-throughput screenings. Consequently, this assay will surely be a valuable tool for the screening of new therapeutic agents as well as for the search of new therapeutic targets present in the host or bacteria. For the application of the method a positive control for intracellular bacterial death is needed, therefore we tested the effect of the lipopolysaccharide (LPS), a previously described potent macrophage activator. Surprisingly, our results show that in M. smegmatis infection, overnight LPS treatment of macrophages results in an increased intracellular survival contrary to the expected bactericidal effect. It was shown that this effect is related to a delay of phagosome maturation instead of a reduced release of free oxygen radicals.
Tipo de Documento
Dissertação de Mestrado
Idioma
Português
Orientador(es)
Anes, Elsa, 1964-; Santos, Mário de Almeida, 1955-
