Author(s):
Patraquim, Pedro Miguel Queirós do Patrocínio, 1985- 
Date: 2010
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/2581
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Biologia molecular; Drosophila; Biologia do desenvolvimento; Teses de mestrado - 2010
Description
Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010 O desenvolvimento é um processo biológico generativo que integra a informação genotípica e o seu contexto ambiental para originar um organismo adulto, com um fenótipo particular. Dado que o fenótipo de um ser vivo é a porção do mesmo que está exposta à acção da selecção natural e o mesmo é em grande parte o resultado dos processos de desenvolvimento, torna-se fulcral estudar a evolução das espécies no contexto das mudanças evolutivas que ocorrem nos mecanismos de desenvolvimento. A evolução dos processos de desenvolvimento dá-se por dois tipos gerais de mudança, de natureza distinta: criação de novos genes efectores (as proteínas) ou mudanças na regulação das mesmas. Vários estudos apontam para a predominância da mudança regulatória enquanto mecanismo para a evolução do desenvolvimento. Entre estes destacam-se os resultados da comparação do complemento proteico do chimpanzé (Pan troglodytes) e do humano (Homo sapiens), revelando que mais de 90% destas são semelhantes entre as duas espécies. Torna-se no entanto necessário entender de que natureza são estas mudanças regulatórias, para que se possa formular um modelo mecanístico de como o desenvolvimento evolui. O contexto da descoberta mencionada acima, pouco depois do início da era da biologia molecular pelas descobertas de Jacob e Monod, que demonstraram que as bactérias E.Coli controlam a expressão dos seus genes através de mudanças na transcrição dos mesmos, tornou o nível transcricional o mais estudado como o locus evolutivo por excelência. Nesta linha, surgiram vários estudos que demonstraram que mudanças espaciais e temporais na transcrição de genes específicos, nomeadamente nas sequências em cis que promovem a mesma, podem ser responsáveis por diferenças morfológicas entre espécies de vários grupos animais, dos insectos aos peixes. Quanto ao modelo apresentado para a predominância da mudança cisregulatória da transcrição na modificação evolutiva do desenvolvimento, este defente que estas sequências (baptizadas de sequências enhancer ou potenciadoras) têm um grande potencial evolutivo, pela sua estrutura compacta e modular (curtas sequências de nucleótidos) escapando assim às consequências deletérias da pleiotropia, assim como pela sua capacidade de recrutar diversos tipos de factores de transcrição (proteínas que promovem o início da transcrição dos genes) de modo combinatório, podendo assim diversificar facilmente o padrão de transcrição dos genes. No entanto, outros níveis menos explorados de regulação da expressão génica também possuem as mesmas características. O nível pós-transcricional, explorado por este trabalho, é um destes casos. Nos eucariotas, após transcrição de um dado gene codificante, o transcrito de ARN é processado de vários modos, por excisão de intrões não codificantes, assim como por modificações nas extremidades 5’ e 3’ da molécula (capping e poliadenilação) que sinalizam o início e o fim do transcrito, respectivamente. O transcrito processado (ARN mensageiro ou ARNm) é translocado do núcleo para o citoplasma, onde é reconhecido pelos ribossomas, dando-se o início do processo de tradução, que descodifica a mensagem contida no ARNm dando origem a uma proteína. Durante o seu ciclo-de-vida, a concentração de cada tipo de ARNm é também regulada, assim como a taxa da tradução do mesmo, para que a quantidade de proteína produzida seja controlada. Vários estudos independentes apoiam o modelo de que grande parte da informação que controla estes eventos está contida na 3’UTR (3’untranslated region ou região não-traduzida em 3’). Como o nome indica, esta sequência está presente nos ARNm dos eucariotas não com o propósito de codificar uma sequência proteica, mas sim porque contém a informação pós-transcricional necessária para a sua regulação. Um dos modos pelos quais a taxa de tradução, assim como a concentração de um dado mRNA são reguladas no citoplasma é a ligação a microARNs. Estes últimos são moléculas curtas de ARN, contendo em média 22 ribonucleótidos, que se associam a complexos proteicos no citoplasma para detectar ARNm específicos, por complementaridade de bases com determinadas sequências-alvo nas suas regiões 3’UTR. Após a sua a ligação às 3’UTRs, os microARNs promovem a deadenilação dos ARNm, assim como a paragem do processamento do mesmo pelo ribossoma, tendo assim um efeito negativo na procução de proteínas. As sequências-alvo dos micro-ARN partilham com os potenciadores da transcrição as características, anteriormente mencionadas, que tornaram os últimos nos principais candidatos a promover mudanças evolutivas na expressão génica. São modulares (8 ribonucleótidos), tendo também capacidade de promover eventos de regulação combinatória (cada 3’UTR tem sequências-alvo para microARNs distintos). Como tal, torna-se claro que a informação cis-regulatória pós-transcricional é também candidata a um factor potenciador da mudança evolutiva nos processos de desenvolvimento. O nosso estudo baseou-se em descobertas recentes referentes à regulação póstranscricional de genes Hox, efectuadas por outros membros do nosso laboratório, assim como por investigadores de outros grupos. Os genes Hox codificam uma família de factores de transcrição que operam durante o desenvolvimento dos animais com simetria bilateral, regulando vários genes-alvo ao nível da transcrição para dirigir programas de desenvolvimento que geram diferentes identidades segmentares ao longo do eixo antero-posterior. Para além desta função conservada, os genes Hox já foram implicados em vários eventos de diversificação evolutiva. Resultados recentes no modelo animal Drosophila melanogaster indicam que este grupo de genes é regulado no nível pós-transcricional, tanto por microARNs (do complexo iab4/iab8) como pela geração de diferentes transcritos codificando a mesma proteína, mas contendo isoformas de 3’UTR distintas (geradas por sinais em cis que medeiam eventos de poliadenilação alternativa). Em mais detalhe, os ARNm dos genes Hox antennapedia, abdominal-a, abdominal-b e ultrabithorax sofrem poliadenilação alternativa durante o desenvolvimento embrionário de Drosophila melanogaster, dando origem a transcritos codificando a mesma proteína mas contendo informações regulatórias distintas. Estas isoformas de 3’UTR são reguladas no espaço e no tempo, e medeiam regulação diferencial por microRNAs. Neste trabalho, recorremos a análises bioinformáticas para explorar a evolução destes eventos de regulação pós-transcricional dos genes Hox, com o intuito de entender quais as forças evolutivas que intervém na evolução das sequências 3’UTR dos genes Hox do género Drosophila. Esta informação, gerada in silico, será depois usada para guiar uma investigação in vitro mais informada, tendo em vista um conhecimento mais profundo da evolução da regulação génica pós-transcricional, e das suas consequências no fenótipo dos animais. A grande quantidade de ferramentas e dados já disponíveis desde o início da era genómica, permitiram-nos um estudo extenso desta questão. Recorremos primeiro a doze genomas de espécies do género Drosophila, isolando as sequências 3’UTR dos genes Hox referidos acima. Alinhámos depois estas mesmas sequências e observámos que existe uma extensa variação no posicionamento das sequências em cis que promovem a poliadenilação alternativa, havendo quase sempre, no entanto, dois sinais alternativos. Estes resultados indicam que a capacidade de gerar duas isoformas de 3’UTR é fulcral para a regulação dos genes Hox em Drosophila, segregando entre as duas informação regulatória diferencial, mas também que existe alguma plasticidade evolutiva no tipo de informação que cada isoforma contém. O tamanho relativo das isoformas também paree ter evoluído substancialmente, apoiando esta ideia. De seguida, examinámos a estrutura secundária dos ARNs das 3’UTRs dos genes Hox para as 12 espécies, e encontrámos um padrão conspícuo de conservação, ao contrário do que acontece ao nível da sequência primária. Isto indica que a realidade tridimentional em que as 3’UTRs destes genes se encontram, ao longo da vida do ARNm, exerce uma pressão selectiva forte para a manutenção de uma estrutura que seja reconhecida pelos reguladores em trans. A regulação por microARNs foi também abordada. Nesta secção, concentrámo-nos em ultrabithorax, usando um sofware desenvolvido para o efeito (PITA) assim como informação de expressão dos miARNs para gerar uma lista de candidatos a reguladores pós-transcricionais. Analisámos em seguida a evolução das sequências-alvo que medeiam a regulação pelos microARN-candidatos e encontrámos dinâmicas quantitativas, que sugerem que houve uma mudança significativa nas sequências 3’UTR no sentido de acomodar diferentes potenciais regulatórios. A dinâmica individual destas sequências-alvo sugere outros paralelos com o modelo de evolução transcricional: observámos que existe, tal como no caso dos enhancers, uma sequência-alvo predominante, responsável pela maioria da afinidade da 3’UTR para cada microARN, assim como sequências acessórias que intervêm pouco na regulação e têm uma evolução mais rápida. Na transcrição, os enhancers acessórios são funcionais apenas na ocorrência de stress ambiental. Dado que os miARNs já foram implicados na robustez do desenvolvimento ao stress ambiental, sugerimos que a existência de sequências-alvo acessórias faça parte do mecanismo pelo qual os microARNs exercem esta função. Finalmente, tentámos formular um modelo geral para a regulação póstranscricional dos genes Hox. Para isto, investigámos a estrutura secundária de todo o transcrito de ARNm de cada Hox, nos diferentes contextos gerados pela poliadenilação alternativa. As 3’UTRs parecem ter uma estrutura modular, estando segregadas tridimensionalmente do resto do transcrito. Este resultado apoia a ideia de que a estrutura secundária é fulcral para a regulação dos genes Hox e ajuda também a explicar os resultados da comparação evolutiva das estruturas secundárias. Para além disso, a região onde se encontra o primeiro sinal de poliadenilação parece sofrer uma remodelação na sua estrutura secundária, que afecta a probabilidade de interacção ARNm-microARN ao mudar a acessibilidade das sequências-alvo aí contidas. Assim, a poliadenilação alternativa parece estar conservada na linhagem Drosophila, apesar de ter diversificado a informação que é segregada para cada uma das isoformas. A evolução da regulação por microARNs parece ter mudado significativamente durante os 60 milhões de anos de evolução destas espécies, e a lista de candidatos que gerámos abre as portas para estudos in vivo de evolução do desenvolvimento por mudanças na regulação em cis do nível pós-transcricional. Adicionalmente, a estrutura secundária do ARN das 3’UTRs parece ser muito importante ao longo da evolução, dada a sua conservação, e é um factor que terá que ser tido em conta, aquando de outros estudos do género. Estamos neste momento a realizar testes in vivo, tendo em vista a validação destes resultados. The Hox genes encode a family of transcriptional regulators that operate differential developmental programs along the anteroposterior axis of animal bodies. Regulatory changes affecting Hox gene expression are believed to have been crucial for the evolution of animal body plans. In Drosophila melanogaster, Hox expression is posttranscriptionally regulated by microRNAs (miRNAs) acting on target sites located in Hox 3' untranslated regions (3’UTRs). Notably, recent work has shown that during development Hox genes produce mRNAs with variable 3'UTRs (short and long forms) in different tissues as a result of alternative polyadenylation; importantly, Hox short and long 3’UTRs contain very different target sites for miRNAs. Here we use a computational approach to explore the evolution of Hox 3'UTRs treated with especial regard to Hox miRNA regulation. Our work is focused on the twelve Drosophila species for which genomic sequences are available, and shows, first, that alternative polyadenylation of Hox transcripts is a feature shared by all Drosophilids tested in the study. Second, that the regulatory impact of miRNAs is evolving very fast within the Drosophila group, and, third, that in contrast to the low degree of conservation observed at the level of primary sequence Hox 3’UTR regions show very similar RNA topology indicating that RNA structure is under strong selective pressure. Finally, we also demonstrate that alternative polyadenylation leading to the formation of short and long Hox 3’UTRs can remodel the control regions seen by miRNAs by at least two mechanisms: by gradually adding target sites to a short 3’UTR form, as well as modifying the regulatory value of multiple miRNA target sites simultaneously through changes in RNA secondary structure.
