Autor(es):
Vaz, Ana Rita Mendonça, 1984- 
Data: 2010
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/2476
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Biologia celular; Biologia molecular; Stress oxidativo; Tese de doutoramento - 2010
Descrição
Tese de doutoramento, Farmácia (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2010 The present dissertation is focused in neonatal hyperbilirubinemia, a very common
condition in the neonatal period, characterized by increased concentrations of unconjugated
bilirubin (UCB). High levels of UCB may lead to bilirubin-induced neurologic dysfunction
(BIND), particularly in premature infants, which may be a starting point to the appearance of
long-term neurodevelopment disabilities. In cultures isolated from rat brain, toxicity induced
by UCB is more pronounced in neuronal cells that in those from glia, and immature cells are
more prone to this injury. Among the UCB-induced cytotoxic effects, are the extracellular
accumulation of glutamate and the up-regulation of inflammatory pathways (mainly in glial
cells), permeabilization of the mitochondrial membrane (in isolated mitochondria), impairment
of neuritic development (in immature cortical and hippocampal neurons) and oxidative stress
(in differentiated neurons). Firstly, we intended to better understand the mechanisms of
neurotoxicity by UCB, mimicking a condition of prematurity, regarding oxidative stress,
mitochondrial dysfunction associated with bioenergetic alterations and cell death, as well as
to study the role of known modulators of oxidant species production in the prevention of
UCB-induced neuronal injury. The obtained results showed that rat immature cortical
neurons exposed to UCB undergo oxidative stress, mitochondrial dysfunction associated
with respiration failure and cell death, effects that are prevented in the presence of
glycoursodeoxycholic acid, a compound with antioxidant and anti-inflammatory properties. In
addition, since prematurity is often associated with sepsis, these studies evaluated the
additional effects of inflammation on hyperbilirubinemia. We demonstrated that UCB induced
nitrosative stress, c-Jun N-terminal kinases 1 and 2 signalling and cell death and that these
effects are intensified by pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor-α and interleukin-
1β, through the same cascade of mediators. Finally, it was investigated whether there is a
dissimilar brain regional susceptibility to UCB-induced oxidative damage and neurite
outgrowth and branching disruption in immature neurons, which might determine the
preferential UCB deposition and brain damage in specific brain areas characteristic of
kernicterus, such as cerebellum and hippocampus, and also the mechanisms that are
involved in the modulation of UCB-induced neurotoxicity. Rat hippocampal neurons were the
most susceptible to UCB-induced oxidative and nitrosative stress, as well as to UCB-induced
neuritic impairment and cell death. N-acetylcysteine, a precursor of glutathione synthesis,
was able to counteract the UCB-induced neurotoxicity. Taken together, these studies will
substantiate target-driven approaches to the prevention and treatment of BIND, and provide
fruitful opportunities for future investigations. A presente dissertação é dirigida para o estudo da hiperbilirrubinémia neonatal, uma
situação clínica frequente durante a primeira semana de vida, resultante da elevação das
concentrações da bilirrubina não conjugada (BNC). A disfunção neurológica induzida pela
bilirrubina (DNIB) poderá ser o ponto de partida para algumas doenças do
neurodesenvolvimento, especialmente nos bebés prematuros. Utilizando modelos de
culturas celulares obtidas a partir de cérebro de rato, verificou-se que a toxicidade induzida
pela BNC é mais pronunciada em neurónios do que em astrócitos, sendo as células mais
jovens particularmente susceptíveis. Do vasto leque de mecanismos moleculares envolvidos
na toxicidade induzida pela BNC, destacam-se a acumulação de glutamato extracelular e a
resposta inflamatória (nas células gliais), a diminuição do desenvolvimento neurítico (em
neurónios do córtex e do hipocampo) e o stresse oxidativo (em neurónios diferenciados).
Numa primeira fase, este trabalho teve como objectivo compreender os mecanismos
associados à lesão pela BNC, no que respeita ao stresse oxidativo, disfunção mitocondrial e
morte celular, assim como avaliar o efeito protector do ácido glico-ursodesoxicólico
(AGUDC), um composto com propriedades anti-oxidantes, em condições que mimetizam
uma situação de prematuridade. Para tal foram utilizadas culturas de neurónios corticais
com 3 dias, obtidos de cérebros de rato. Neste modelo, a exposição à BNC conduziu ao
stresse oxidativo, disfunção da respiração mitocondrial, e consequente morte celular, efeitos
que foram prevenidos na presença do AGUDC. De seguida, avaliaram-se os efeitos
adicionais da incubação concomitante da BNC com as citocinas pro-inflamatórias,
mimetizando uma reacção inflamatória associada à hiperbilirrubinémia. Utilizando o mesmo
modelo, observou-se que tanto o stresse nitrosativo, como a morte celular surgem
aumentados após esta a incubação concomitante da BNC com as citocinas proinflamatórias,
estando envolvidos os mesmos mediadores e vias sinalizadoras. Por fim,
investigou-se de que forma o padrão de deposição específico da BNC encontrado na
patologia de kernicterus é determinado pela diferente vulnerabilidade regional à lesão
oxidativa e ao desenvolvimento neurítico pela BNC. Para tal, isolaram-se neurónios não só
do córtex mas também do hipocampo e do cerebelo de rato. Os neurónios do hipocampo
mostraram ser mais susceptíveis ao stresse oxidativo e nitrosativo induzidos pela BNC,
assim como à disfunção do desenvolvimento neurítico e à morte celular. A incubação com o
precursor da síntese da glutationa N-acetilcisteína preveniu os efeitos tóxicos induzidos pela
BNC. Em conclusão, estes resultados contribuem para o melhor conhecimento dos
mecanismos moleculares subjacentes à DNIB no período neonatal, tendo as moléculas com
capacidade anti-oxidante um efeito notório na prevenção desta disfunção.
