Autor(es):
Cabaço, Helena Isabel Marques Nunes, 1979- 
Data: 2010
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/2277
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Timo; Linfócitos T; Linfócitos T reguladores; Fatores de transcrição forkhead; Teses de doutoramento - 2010
Descrição
Tese de doutoramento, Medicina (Ciências Biomédicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2010 O timo é um órgão linfóide primário essencial para o desenvolvimento das
células T, sendo responsável pela formação de um repertório capaz de combater
possíveis patogéneos estranhos ao organismo sem comprometer a tolerância ao próprio.
Esta tolerência é maioritariamente garantida pelo timo, quer pela eliminação de
linfócitos T potencialmente auto-reactivos, quer pela produção de uma população de
células T, denominadas células T regulatoras (Treg), devotada ao controlo da resposta
imune, particularmente no contexto de processos autoimunes e inflamatórios.
A diferenciação no timo de progenitores provenientes da medula óssea em
células T CD4 ou CD8 maduras ocorre através de uma sequência de estadios de
desenvolvimento que podem ser definidos com base na expressão das moléculas CD3,
CD4 e CD8. Em humanos, células CD4- CD8- CD3- triplamente negativas (TN) adquirem
inicialmente CD4 (estadio CD4 monopositivo imaturo, CD4ISP) e posteriormente CD8,
tornando-se células CD4+ CD8+ duplamente positivas (DP). Na sequência de rearranjos
genéticos do receptor de células T (TCR), este é expresso à superfície e é testada a sua
capacidade de reconhecer o complexo de histocompatibilidade major (MHC),
fundamental para a apresentação de antigénios. Células cujo TCR não reconheça MHC
morrem por apoptose (“morte por negligência”). Apenas células apresentando TCRs que
reconhecem MHC do próprio recebem sinais de sobrevivência (“selecção positiva”) e de
diferenciação em células T CD4 ou CD8 maturas. Estudos no ratinho mostram que a
intensidade e duração da sinalização pelo TCR durante a diferenciação tímica são
determinantes na decisão de uma célula se tornar uma célula T CD4 ou CD8. Uma
sinalização excessivamente intensa pelo TCR induz “selecção negativa”, resultando na
apoptose de linfócitos potencialmente autoreactivos. A sinalização pelo TCR é também
essencial para o desenvolvimento tímico de Tregs. Pensa-se que a sua selecção ocorre
num intervalo muito restrito de afinidade das ligações TCR-ligando, entre a selecção
positiva de células T convencionais e a selecção negativa de linfócitos T autoreactivos
com TCR de alta afinidade. Neste sentido, tem sido atribuída às Tregs a característica
peculiar de possuírem uma autoreactividade aumentada.
Actualmente, o factor de transcrição Foxp3 (forkhead box P3) é considerado o
marcador mais adequado para a identificação de Tregs. O seu papel essencial no
desenvolvimento e função de Tregs é suportado pela associação de mutações de Foxp3 com o síndrome fatal IPEX (immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked
syndrome, síndrome auto-imune linfoproliferativo severo) e também pelo síndrome
autoimune fatal observado em ratinhos scurfy, “naturalmente” deficientes em Foxp3.
Outras moléculas cuja expressão tem também sido associada a Tregs incluem a cadeia α
do receptor de interleucina 2 (IL-2Rα, CD25), CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen
4), o ectoapirase CD39 e baixos níveis da cadeia α do receptor de IL-7 (IL-7Rα, CD127).
Neste estudo investigámos o desenvolvimento de Tregs, identificadas pela
expressão de Foxp3 e de outros marcadores associados, em timos de indivíduos em
idade pediátrica. Em particular, perguntámos quando ocorre o comprometimento dos
timócitos para a linhagem de Tregs durante o desenvolvimento, uma vez que esta
questão é relevante para o repertório das Tregs. Perguntámos ainda como se compara o
desenvolvimento das Tregs com o de linfócitos T convencionais.
Na primeira parte do trabalho analisámos o padrão de expressão de Foxp3 em
timócitos humanos e murinos. Os nossos resultados revelam a expressão de Foxp3 em
fases anteriores ao estadio DP, nomeadamente em timócitos no estadio CD4ISP em
humanos e no estadio CD4- CD8- duplamente negativo 4 (DN4) em ratinhos. Mostram
ainda que, em ratinhos, células Foxp3+ DN4 possuem rearranjos genéticos da cadeia α
do TCR (TCRα). Recorrendo ao ratinho deficiente em TCRα como uma ferramenta
genética mostramos que, na ausência de TCRα, a expressão de Foxp3 no estadio DN4 é
abolida. Colectivamente, os nossos dados revelam a expressão de Foxp3 em fases pré-DP
em timócitos humanos e murinos e confirmam que a expressão precoce de Foxp3 é
dependente do TCR.
Na segunda parte do trabalho estudámos a indução de Foxp3 no estadio DP e a
possível diferenciação de timócitos Foxp3+ DP no estadio mais maturo Foxp3+ SP.
Usando um ensaio de reexpressão, que consiste na clivagem de moléculas de superfície
usando pronase e na síntese e reexpressão em cultura de moléculas transcripcionalmente
activas, mostramos que a expressão de Foxp3 na fase DP ocorre em “verdadeiras”
células DP. Mostramos ainda que os timócitos Foxp3+ DP apresentam um fenótipo
maturo e uma distribuição das famílias TCR Vβ que se assemelha à dos timócitos DP que
não expressam Foxp3. Identificamos também uma população de timócitos Foxp3+ DP
que apresenta um aumento do programa transcripcional associado com o fenótipo
activado/supressor na periferia, expressando elevados níveis de marcadores associados
com Tregs, tais como CD25, CTLA-4, CD39 e MHC classe II (HLA-DR). Esta população
está também presente em timócitos Foxp3+ CD4SP, nos quais a intensidade de expressão dos marcadores supramencionados parece decair antes da exportação das células do
timo para a periferia. Os timócitos Foxp3+ CD8SP não apresentam a referida população,
mas expressam a molécula CD103 (αE), constituinte da integrina αEβ7. A expressão de
CD103 está associada com a migração para a mucosa, o que pode explicar os níveis
reduzidos de Tregs CD8 circulantes. Mostramos ainda que a molécula CD103 está já
presente em células Foxp3+ no estadio DP, o que sugere uma possível relação precursorprogenia
entre os timócitos Foxp3+ CD103+ DP e CD8SP. A possível diferenciação de
timócitos Foxp3+ DP em Foxp3+ SP foi analisada com base num modelo estatístico de
análise de regressão múltipla. Este modelo suporta um contributo significativo das
células Foxp3+ DP para o pool Foxp3+ SP. Em resumo, os nossos dados indicam que
Foxp3 é induzido na fase DP e que uma parte significativa dos timócitos Foxp3+ DP se
diferencienciam em células Foxp3+ SP, que irão incorporar o pool de Tregs na periferia.
Em contraste com o que é observado na periferia, mostramos que uma fracção
significativa dos timócitos Foxp3+ DP expressa níveis consideráveis do receptor de IL-7.
A funcionalidade deste receptor à superfície dos timócitos Foxp3+ DP foi confirmada
através do estado da fosforilação da molécula STAT5 (signal transducer and activator of
transcription 5), associada à acção da IL-7, após estimulação de timócitos com esta
citoquina. Mostramos ainda que IL-7 induz o aumento de intensidade de CD25 nos
timócitos Foxp3+ DP em cultura. Estes resultados sugerem que a IL-7 poderá ter um
papel significativo no desenvolvimento timico de Tregs em humanos. Esta observação
pode ser de importância particularmente significativa em situações onde há alterações
dos níveis de IL-7, tal como no contexto de situações clínicas de linfopénia como
observado, por exemplo, na patologia do HIV.
Em conclusão, os nossos dados suportam que a expressão de Foxp3 em timócitos
humanos requer sinalização pelo TCR e ocorre antes da decisão CD4 vs. CD8.
Mostramos que os timócitos Foxp3+ DP expressam um fenótipo activado semelhante ao
apresentado em Tregs activadas na periferia mas associado à expressão de receptor de
IL-7 funcional, o que naquela fase possivelmente protege os timócitos de
apoptose/selecção negativa. Identificámos ainda uma subpopulação das células Foxp3+
DP que expressa CD103 e que está provavelmente na origem das células Foxp3+ CD8SP,
com migração preferencial para a mucosa. Finalmente, modelos de análise de regressão
múltipla suportam que um comprometimento significativo para a linhagem Treg ocorre
na fase DP, com possíveis implicações para o repertório e função da população de Treg. Estudos humanos, Timo, Desenvolvimento de Células T, Células T
reguladoras, Foxp3. The thymus is a primary lymphoid organ crucially involved in the development
of T cells. While producing a self-tolerant T cell repertoire that warrants surveillance to
foreign pathogenic threats, the thymus also produces a lineage of regulatory T cells
(Tregs) that are deeply involved in the control of immune responses, particularly in the
context of inflammatory and autoimmune processes.
Differentiation of blood-derived T cell progenitors to mature CD4 or CD8 T cells
in the thymus is accomplished by sequential development through a series of stages that
can be defined by the expression of CD3, CD4 and CD8. In humans, CD4-CD8-CD3-
triple negative (TN) cells first acquire CD4 (CD4 immature single positive stage, CD4ISP
stage) and then CD8 to become CD4+CD8+ (double positive stage, DP stage) cells. Upon
T cell receptor (TCR) gene rearrangements, DP cells “test” their TCR for recognition of
the antigen-presenting molecules named major histocompatibility complex (MHC).
While cells that are unable to recognize self-MHC undergo “death by neglect”, DP
thymocytes bearing TCRαβ complexes that can engage self-MHC molecules are signaled
to survive, a process designated as “positive selection”, and to differentiate into
functionally mature CD4 single positive (CD4+CD8-CD3high, CD4SP) or CD8 single
positive (CD4-CD8+CD3high, CD8SP) T cells. Data from mouse models suggest that the
strength and duration of TCR signaling is determinant in CD4 vs. CD8 lineage decision
during thymic differentiation. Strong TCR signaling induces “negative selection”,
resulting in programmed cell death of potentially auto-reactive cells. TCR signaling has
been shown to be essential for Treg differentiation in the thymus. It has been proposed
that Treg selection may occur within a very narrow window of affinity of TCR-ligand
interactions, between positive selection of conventional CD4 T cells and negative
selection of high-affinity self-reactive T cells. In agreement, increased self- reactivity is
considered a unique feature of Tregs.
At present, the forkhead winged-helix transcription factor Foxp3 is considered
the best available marker to identify Tregs. The essential role of Foxp3 in Treg
development and function is supported by the association of Foxp3 defects with the fatal
condition IPEX (immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked
syndrome) and also by the lethal autoimmune syndrome observed in scurfy and Foxp3
knock-out mice. Other molecules whose expression has also been associated with Treg function include the interleukin 2 receptor α chain (IL-2Rα, CD25), the cytotoxic Tlymphocyte
antigen 4 (CTLA-4), the ectoapyrase CD39 and low levels of the IL-7
receptor α chain (IL-7Rα, CD127).
We have investigated the development of human Tregs, as identified by the
expression of Foxp3, as well as of other Treg-associated markers, in human pediatric
thymuses. Specifically, we asked when commitment to the Treg lineage occurred during
T cell development, since this is particularly relevant for the generation of the Treg
repertoire. In addition, we assessed the developmental pathway of Tregs in the thymus.
In particular, we asked whether Treg development occurred similarly to what is
observed in conventional, Foxp3- T cells.
In the first part of the work we dissected the early expression pattern of Foxp3 in
human and murine thymocytes and showed that Foxp3 expression can be detected in
pre-double positive (pre-DP) subsets, particularly in CD4ISP thymocytes in humans and
in double negative stage 4 (DN4) cells in mice. We further showed that Foxp3-expressing
murine thymocytes at the DN4 stage possess productive TCRα gene rearrangements. In
addition, using the TCRα-deficient mouse model as a genetic tool we have found that
Foxp3 expression was abolished in TCRα-deficient DN thymocytes. Collectively, our
data have identified the pre-DP expression of Foxp3 in human and murine thymocytes
and confirmed the TCR-dependency of the early Foxp3 expression in pre-DP
thymocytes.
In the second part of the work we studied the induction of Foxp3 at the DP stage
and the possible differentiation of Foxp3+ DP thymocytes into the SP stages. Using a reexpression
assay, where surface molecules were cleaved using pronase and
transcriptionally active molecules were allowed to be synthesized and re-expressed, we
were able to show that Foxp3 expression at the DP stage occurs in bona fide DP
thymocytes. We also showed that Foxp3+ DP thymocytes have a mature phenotype and
a TCR Vβ family distribution that closely resembled that of Foxp3 negative DP
thymocytes. We further found that a population within Foxp3-expressing DP
thymocytes presented an up-regulation of the transcriptional program associated with
an activated/suppressor phenotype in the periphery and expressed high levels of the
Treg-associated markers CD25, CTLA-4, CD39 and MHC class II (HLA-DR). This
population was also found within Foxp3+ CD4SP thymocytes, in which the expression
of those markers appeared to decline prior to thymic egress. While Foxp3+ CD8SP thymocytes were devoid of high expression of those markers, they homogeneously
expressed CD103 (αE), which is part of the αEβ7 integrin. CD103 expression is associated
with migration to the mucosa, which might explain the very low levels of circulating
CD8 Tregs. In addition, we found that Foxp3+ cells expressing CD103 were already
present at the DP stage, indicating possible precursor-progeny relationship between
Foxp3+CD103+ DP and CD8SP thymocytes. In order to further investigate a possible
direct precursor-progeny association between Foxp3-expressing DP and SP cells we
performed statistical analysis of our data using multiple regression analysis. This model
supported the significant weight of Foxp3+ DP cells to the SP pool. Overall, our data
thus indicate that considerable Foxp3 induction occurs at the DP stage and that a
significant part of Foxp3+ DP thymocytes probably progresses to the SP stages, and will
incorporate the Treg pool upon thymus egress.
In addition, and in clear contrast to what is observed in the periphery, we found
that a large proportion of Foxp3+ DP thymocytes expressed considerable levels of IL-7
receptor (IL-7R). We assessed the functionality of IL-7R at the surface of Foxp3+ DP cells
and showed that phosphorylation of STAT5 (“signal transducer and activator of
transcription 5”), a downstream target of IL-7, was readily observed upon exposure to
that cytokine. Furthermore, short-term culture with IL-7 induced the upregulation of
CD25 on Foxp3+ DP thymocytes. Together, these results suggest that IL-7 may play a
role in the development of human Tregs. Although requiring further investigation, this
finding may be of particular significance in the context of situations where IL-7 levels are
altered, such as lymphopenia, as observed in HIV pathology.
In conclusion, our data support that the expression of Foxp3 in human
thymocytes requires TCR signaling and occurs prior to CD4 or CD8 lineage
commitment. Foxp3+ DP thymocytes were shown to express an activated phenotype
that is reminiscent of that found in peripheral activated Tregs but is associated with the
expression of a functional IL-7 receptor, which may protect them from cell
death/negative selection. A subpopulation of Foxp3+ DP expressing CD103 is likely to
give rise to a population of Foxp3 CD8 T cells with preferential homing to the mucosa.
Finally, multiple regression models support that a significant commitment to the Treg
lineage occurs at the DP stage, with possible implications for Treg repertoire and
function. Human studies, Thymus, T cell development, Regulatory T cell, Foxp3.
