Author(s):
Moita, Catarina Susana Ferreira, 1978- 
Date: 2010
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/2239
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Antígénios de neoplasias; Células dendríticas; Células; Dissecação; RNA; Imunidade inata; Imunidade adaptativa; Imunidade; Teses de doutoramento - 2010
Description
Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Morfológicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2010. Effective immune responses against tumor antigens that are not endogenously
expressed by dendritic cells (DCs) and against virus that do not infect antigen
presenting cells (APCs) require extracellular antigens to stimulate CD8+ T cells
via the MHC I pathway through a process known as cross-presentation.
The molecular mechanisms that direct endocytosed antigens from the
classical MHC II-restricted presentation pathway to the MHC I pathway are for
the most part not understood. We have completed a screen for genes with a role
in this process using a subset of an shRNA lentiviral library enriched for mouse
kinases and phosphatases. In this screen we measured the proliferation of CD8+
T (OT-I) cells in response to the stimulation of bone marrow derived DCs
(BMDCs) by OVA-expressing S. cerevisiae. After testing over 1000 genes in
duplicate and two rounds of phenotypic validation, we have chosen ~80 genes
that reproducibly caused increased (more than 1.5 SDEV) or reduced (less than
1.2 SDEV) rates of CD8+ T proliferation.
We also tested these 80 genes in a similar assay but using B3Z as the
responder cell line. We have found that 15 genes caused a significant change in
the levels of IL-2 production. Because IL-2 production by this cell line requires
presentation of the SIINFEKL peptide by MHC I but it is co-stimulator
independent, it is likely that this group of genes regulates presentation while the
other group regulates co-stimulator induction.
We performed qPCR validation of the knockdowns and additional secondary
screens on this group of 80 genes so that we could identify those that are
specifically required for cross-presentation. Among these we validated 1 novel
gene that seems to be predominatly involved in cross-presentation, which is a
good candidate for follow-up mechanistic studies. Interestingly, it is neither a
kinase nor a phosphatase.
Therefore, my results suggest that the overwhelming majority of kinases and
phosphatases involved in antigen presentation play a role in both canonical and
antigen cross-presntation pathways. In the hope to find genes that specifically
regulate antigen cross-presentation, I decided to expand our search to include
most known genes with a role in vesicle traffic within the cell. In this second
phase of our screen we measured the proliferation of CD8+ T (OT-I) cells in
response to the stimulation of BMDCs after incubation with soluble OVA. After
testing 155 genes, we have chosen 44 genes that reproducibly caused increased
(more than 1.0 SDEV) or reduced (less than -0.7 SDEV) rates of CD8+ T
proliferation to be tested in the MHC class II pathway. We found 12 genes that
caused a significant change in the levels of OT-I proliferation, but had moderate
or no effect on Class II antigen presentation. We performed qPCR validation of
the knockdowns on this group of 12 genes and identified 8 novel genes with good correlation profiles. These are excellent candidates for future mechanistic
studies and the exploration of their in vivo role in antigen cross-presentation in
different biologically relevant contexts. Uma resposta imunitária eficaz contra antigénios tumorais, que não são
endogenamente expressos por células dendríticas, e contra vírus que não
infectem células apresentadoras de antigénios, requer a estimulação de células
T CD8+ por parte de antigénios extracelulares via moléculas MHC I, num
processo denominado de “apresentação cruzada de antigénios”.
Os mecanismos moleculares que direccionam antigénios endocitados do
processo clássico de apresentação restringido a moléculas MHC II, para a via de
classe I são largamente desconhecidos.
Realizámos um screen com o objectivo de identificar genes envolvidos neste
processo, usando uma parcela de uma biblioteca lentiviral de shRNA
enriquecida em cinases e fosfatases de ratinho. Neste screen, foi medida a
proliferação de células T CD8+ (OT-I) em resposta à estimulação de células
dendríticas derivadas da medula óssea após incubação com S. cerevisiae
expressando ovalbumina. Após testar mais de 1000 genes em duplicado e
realizando duas fases de validação fenotípica, foram escolhidos cerca de 80
genes que repetidamente causaram um aumento (mais de 1.5 SDEV) ou
diminuição (menos de -1.2 SDEV) na taxa de proliferação de células T CD8+.
Os referidos 80 genes foram igualmente testados num ensaio idêntico
utilizando a linha celular B3Z. Foram identificados 15 genes cuja secreção de
interleucina-2 (IL-2) foi significativamente diferente dos controlos. Dado que a
secreção de IL-2 por esta linha celular requer a apresentação do péptido
SIINFEKL associado à molécula de MHC I, mas esta é independente da
expressão de moléculas co-estimuladoras, é plausível que este grupo de genes
possa regular a apresentação, enquanto que os restantes tenham um papel na
indução de co-estimuladores.
Realizaram-se validações por qPCR dos níveis de knockdown, bem como
screens secundários adicionais no grupo de 80 genes para que pudessem ser
identificados os especificamente envolvidos na apresentação cruzada de
antigénios. Neste grupo identificámos 1 gene que parece estar
predominantemente envolvido na apresentação cruzada em antigénios, o qual é
um bom candidato para estudos mecanísticos posteriores.
Os resultados descritos sugerem que a maioria das cinases e fosfatases
envolvidas na apresentação de antigénios desempenham um papel quer na via
canónica, quer na de apresentação cruzada dos mesmos. Como tal, decidimos
expandir a nossa pesquisa por forma a incluir todos os genes descritos com um
papel no tráfego vesicular da célula. Nesta segunda fase, medimos a
proliferação de células T CD8+ (OT-I) em resposta à estimulação de células
dendríticas derivadas da medula óssea incubadas com ovalbumina solúvel.
Após testar 155 genes no contexto da apresentação cruzada de antigénios, foram escolhidos 44 genes que reprodutivelmente causaram um aumento (mais
de 1.0 SDEV) ou diminuição (menos de -0.7 SDEV) na taxa de proliferação de
células T CD8+ para serem testados no contexto de apresentação por moléculas
MHC II.
Foi observado que 12 genes causam uma alteração específica nos níveis de
proliferação de células OT-I e com um efeito moderado ou mesmo inexistente
ao nível da apresentação em classe II. Realizaram-se validações por qPCR dos
níveis de knockdown destes 12 genes e foram identificados 8 genes com bons
perfis de correlação. Estes constituem excelentes candidatos para futuros
estudos mecanísticos e para a investigação do seu papel in vivo na
apresentação cruzada de antigénios em diferentes contextos biológicos.
