Produção de vectores de adenovírus caninos:optimização do processo na perspecti...

• Author(s): Fernandes, Paulo David Machado dos Santos
• Date: 2009
• Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/1810
• Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
• Subject(s): Biologia celular; Cultura de células; Adenovirus; Teses de mestrado
• Document Type: Master Thesis
• Advisor(s): Caeiro, Filomena; Alves, Paula

Description

Tese de mestrado, Biologia (Microbiologia Aplicada), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências Introdução: Os vectores derivados de adenovírus caninos tipo 2 (CAV-2) possuem umgrande potencial em terapia génica uma vez que circunscrevem os problemas encontrados na utilização dos vectores virais mais comuns adenovírus humanos nomeadamente a memória imunitária o que implica o aumento de doses a administrar por pessoa. Até à data os vectores de CAV-2 são produzidos em frascos de cultura utilizando células DK como produtoras. Por isso é necessário desenvolver um sistema de cultura que permita o aumento de escala de produção e a utilização de linhas celulares previamente aprovadas para produção de fármacos para humanos. Os aspectos mais importantes na optimização de bioprocessos são: crescimento e manutenção das células em sistema agitado e estratégias de infecção. Deve também existir um esforço no sentido da utilização de meios de cultura definidos e sem soro. Objectivo: Este trabalho pretende optimizar a produção de vectores CAV-2 de primeira geração em células MDCK, aprovadas pela FDA, em sistema de tanque agitado utilizando meio de cultura sem soro. Resultados: Foi possível obter vectores virais em células MDCK E1 sendo a produtividade semelhante à obtida em células DK E1. Foi ainda demonstrado ser possível obter produtividades semelhantes em meio de cultura sem soro. Na adaptação do crescimento celular em sistema agitado a produtividade volumétrica das células MDCK E1 manteve-se em meio com soro. No entanto em meio sem soro não foi possível manter a produtividade viral devido ao efeito dos produtos do metabolismo celular. Conclusão: Este trabalho permitiu identificar e definir factores importantes para a produção de CAV-2 utilizando células MDCK E1 em sistema agitado em meio sem soro ou com redução significativa de soro. De futuro pretende-se optimizar o processo de modo a possibilitar e maximizar a produção viral utilizando estratégias de redução da quantidade de lactato produzido pelas células. Introduction: Vectors derived from Canine Adenovirus type 2 possess a great potential for gene therapy because they can overcome the problems found in the utilization of the most common virus-derived vectors human adenovirus namely the immunitary memory which implies the increase of dosage to administrate to people. Until now, CAV-2 vectors are produced in lab-scale Tissue flasks using DK cells being necessary to develop a culture system that allows the scale-up of production. By that, the most important aspects in optimization are: growth and maintenance of cells in suspension system and infection strategies. There should be also an effort to use serum-free media culture. Goal: This work intends to optimize the production of first generation CAV-2 vectors in MDCK cells, approved by FDA, in stirred tank system using serum-free media. Results: The results show that it is possible achieve viral vectors using MDCK E1 cells as producers, where the productivity is equal to that obtained by DK E1 cells. It was also demonstrated that it is possible obtain similar productivities in serum-free media. In cell growth adaptation in suspension system the volumetric productivity of MDCK E1 cells was maintained in serum supplemented medium. However, for the serum-free media cultures, it was not possible to maintain viral productivity because of the cell metabolism products. Conclusion: This work allowed the definition of important factors for the CAV-2 production using MDCK E1 cells in suspension using serum-free media and with significant reduction of serum used. Future work aims to complete the optimization of the process to enable and maximize the viral production using strategies for reducing the amount of lactate produced by cells.