Autor(es):
Moniz, Sónia Cristina da Rocha Pereira, 1973- 
Data: 2007
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/1673
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Genética molecular; Teses de doutoramento
Descrição
Tese de doutoramento em Bioquímica (Genética Molecular), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2008 Segundo os dados da Organização Mundial de Saúde, o cancro é ainda uma das principais causas de morte em todo o mundo. No entanto, o conhecimento adquirido sobre as causas e os mecanismos envolvidos no desenvolvimento e progressão tumorais teve muito impacto na prevenção, detecção precoce e tratamento desta doença. A tumorigénese resulta da acumulação de alterações genéticas que se reflectem na desregulação de mecanismos fundamentais para o controlo da sobrevivência, crescimento e proliferação celulares (Hanahan & Weinberg, 2000). A regulação destes mecanismos depende de vias de transdução de sinal, as quais são responsáveis pela conversão dos estímulos extracelulares em respostas celulares adequadas. Dada a sua importância no desenvolvimento tumoral, torna-se essencial compreender os mecanismos envolvidos na regulação destas vias de forma a encontrar potenciais alvos moleculares para o desenvolvimento de novas terapêuticas. A via de transdução de sinal Ras‐Raf‐MEK‐ERK é uma das principais cascatas de transdução de sinais proliferativos originados em receptores de factores de crescimento. Assim se explica que em cerca de um terço dos casos de cancro se encontrem alterações na expressão ou estado de activação de um ou mais dos seus componentes (Dhillon et al, 2007). As proteínas WNK (with no lysine = K) são uma subfamília de proteínas cinases eucariotas, caracterizadas por possuírem uma alteração na sequência dos seus domínios catalíticos que se traduz na substituição de um resíduo conservado de lisina, responsável pelo posicionamento correcto do ATP na reacção de fosforilação, por um resíduo de cisteína. Estas alterações na sequência primária originam uma estrutura secundária característica e relevante para a sua actividade (Xu et al, 2000; Min et al, 2004). Existem quatro genes WNK no genoma humano (Veríssimo & Jordan, 2001) e foram encontradas mutações germinais nos genes WNK1 e WNK4 em doentes com um sindroma de hipertensão familiar chamado pseudo‐hipoaldosteronismo tipo II (também conhecido como sindroma de Gordon) (Wilson et al, 2001). Desde então têm-se desenvolvido vários trabalhos de investigação na tentativa de compreender os mecanismos moleculares que ligam estas alterações genéticas à patologia. Como resultado, as proteínas cinases WNK1, WNK3 e WNK4 têm sido associadas à regulação da actividade e/ou expressão na membrana citoplasmática de diversos canais e transportadores iónicos, principalmente nos túbulos distais do nefrónio (Kahle et al,2004; Gamba, 2005; Kahle et al, 2006). No entanto, existem evidências experimentais que associam estas proteínas a diversas outras funções celulares, nomeadamente a vias de sinalização envolvidas na proliferação e sobrevivência celulares. Por exemplo, a proteína cinase WNK1 é necessária para a activação da MAPK (mitogen‐activated protein kinase) ERK5, aquando da estimulação de células epiteliais com factores de crescimento (Xu et al, 2004), e, à semelhança da proteína cinase WNK4, fosforila também a proteína Smad2,que tem um papel regulador da sinalização TGFß‐Smad (Lee et al, 2007). Por outro lado, enquanto a redução nos níveis intracelulares de WNK1 reduz a capacidade de proliferação e migração duma linha de células progenitoras de neurónios (Sun et al, 2006), o mesmo tipo de redução na expressão de WNK1 promove a proliferação celular de pré-adipócitos induzida pela estimulação com insulina (Jiang et al, 2005). Por sua vez, a expressão de proteína cinase WNK3 em células HeLa, aumenta a sua resistência à apoptose induzida após tratamento com actinomicina D (Veríssimo et al, 2006). A proteína cinase WNK2 é o membro menos caracterizado desta família de proteínas cinases e o trabalho apresentado nesta tese descreve a clonagem da sequência codificante do gene WNK2 humano e a caracterização funcional da proteína por este originada. A produção de um anticorpo que permite a detecção específica da proteína cinase WNK2 tornou possível a análise da sua expressão em extractos de tecidos humanos de cérebro e músculo, bem como nas linhas celulares HT29 (carcinoma do cólon), HeLa (carcinoma cervical) e HEK 293 (células embrionárias de rim). Estes resultados confirmaram evidências prévias, obtidas por Northern blot e RT‐‐PCR, de uma elevada expressão do transcrito de WNK2 em tecido cardíaco e tecido muscular esquelético bem como uma expressão mais reduzida no cérebro e intestino delgado (Veríssimo & Jordan, 2001). Em seguida foram realizados ensaios de cinase, imunoprecipitando quer a proteína endógena a partir de células HT29, quer a proteína expressa ectopicamente em células HEK 293, nos quais foi possível observar que a proteína cinase WNK2 possui a capacidade de se autofosforilar, embora se desconheçam ainda os seus substratos específicos. Posteriormente foi avaliado o efeito da supressão da expressão de WNK2 por interferência de RNA na activação da MAPK ERK5 tendo-se observado que, ao contrário do que havia sido descrito para a proteína cinase WNK1, esta não era afectada. No entanto, e também contrariamente ao que fora reportado para a proteína cinase WNK1 (Xu et al, 2000; Xu et al, 2004), à redução da expressão endógena de WNK2 corresponde um aumento de actividade das MAPK ERK1/2, em condições de crescimento normais. Com o propósito de determinar se o efeito observado na activação de ERK1/2 se encontrava relacionado ou não com a actividade catalítica de WNK2, foi construído por mutagénese dirigida um mutante de WNK2 em que o resíduo de lisina responsável pela actividade catalítica nas proteínas cinases WNK (resíduo de lisina 207 na WNK2) foi substituído por um resíduo de metionina (Xu et al,2000). A sobre‐expressão deste mutante cataliticamente inactivo de WNK2 resultou num aumento na activação das MAPK ERK1/2 equivalente ao observado quando se inibiu a expressão de WNK2 por interferência de RNA. Isto sugere que o efeito da proteína cinase WNK2 sobre a activação das proteínas ERK1/2 está relacionado com a sua actividade catalítica. No entanto, o efeito de WNK2 na activação de ERK1/2 é dependente da estimulação por factores de crescimento, uma vez que, nem a redução de expressão da proteína cinase WNK2 endógena nem a sobre expressão do respectivo mutante cataliticamente inactivo, promovem a activação de ERK1/2 quando as células são mantidas em meio deprivado de factores de crescimento. Por outro lado, a sobre expressão da proteína cinase WNK2 selvagem por si só não diminui os níveis endógenos de ERK1/2 activas mas tem um efeito inibidor da sua activação quando as células são estimuladas com uma baixa concentração do factor de crescimento EGF. Também se observa que a redução da expressão endógena de WNK2 tem um efeito potenciador da activação de ERK1/2 por factores de crescimento, dado que em células tratadas com RNAs interferentes específicos para a proteína cinaseWNK2 se obtêm, com uma concentração de EGF dez vezes inferior, os mesmos níveis de ERK1/2 activas que em células tratadas com RNAs interferentes controlo. Assim, pode concluir-se que as proteínas cinases WNK1 e WNK2 estão envolvidas na regulação de duas vias de sinalização distintas e que a WNK2 tem um efeito de modulação negativa da activação por factores de crescimento da via de sinalização conducente à activação das proteínas ERK1/2.A regulação da activação das MAPK ERK1/2 condiciona a resposta celular aos factores de crescimento e é determinante para a indução de progressão no ciclo celular e consequente aumento na divisão celular (Ebisuya et al, 2005). De facto, oaumento de ERK1/2 activas decorrente da redução da expressão endógena de WNK2, teve como consequência um aumento do número total de células, das quais uma maior percentagem se encontrava em fase S do ciclo celular, em comparação com células que expressam níveis basais de WNK2. Em concordância com estes dados, um estudo sobre regulação epigenética em tumores humanos, divulgado durante a fase final deste trabalho, encontrou silenciamento da expressão do gene WNK2, por metilação do respectivo promotor, numa elevada percentagem de gliomas. Foi assim proposto um papel de WNK2 como gene supressor de tumor (Hong et al, 2007), compatível com o papel inibidor da proliferação celular observado no presentetrabalho. No que diz respeito ao mecanismo molecular por detrás deste efeito, foitambém demonstrado que a acção da proteína cinase WNK2 sobre a activação das proteínas ERK1/2 se estende aos seus activadores imediatamente a montante na via, ou seja às proteínas cinases MEK1/2. No entanto, os restantes componentes a montante nesta via (B‐Raf, C‐Raf e Ras) não são afectados.Por outro lado, observou‐se também que a redução da expressão endógena deWNK2 se correlaciona ainda com um aumento de fosforilação da proteína MEK1 no resíduo de serina 298, um resíduo com um importante papel regulador, que contribui não só para a activação desta cinase como também constitui um ponto de convergência de sinalização conduzida por vias de sinalização paralelas (Frost et al, 1997; Coles & Shaw, 2002; Eblen et al, 2002; Slack‐Davis et al, 2003). A proteína MEK1 pode ser fosforilada directamente no seu resíduo de serina 298 pela proteína cinase PAK1 (Frost et al, 1997; Coles & Shaw, 2002) em situações favoráveis à migração e proliferação celulares(Slack‐Davis et al, 2003). Foi por nós demonstrado que a proteína cinase WNK2 não afecta directamente a fosforilação das proteínas cinases MEK1 ou PAK1 mas antes que a redução da sua expressão endógena promove um aumento indirecto da actividade da proteína cinase PAK1. Era já conhecido que a cinase PAK1 é um efector da GTPase Ra The subfamily of eukaryotic WNK protein kinases is characterized by a unique placement of the catalytic lysine responsible for correct positioning of ATP within the catalytic domain. WNK1 and WNK4 have been described as disease causing genes in pseudohypoaldosteronism type II, a familial hypertension syndrome. The molecular mechanisms underlying this condition involve the regulation of electrolyte homeostasis in the kidney and the modulation of diverse ion channels and transporters through WNK kinases. WNK proteins have also been reported to participate in signal transduction pathways related to cell growth and survival, however, the role of WNK2 has not been elucidated yet. In this thesis the cloning and functional characterization of human WNK2 is described. It is shown that the depletion of endogenous WNK2 expression by RNA interference in human cervical HeLa cancer cells leads to the activation of the ERK1/2 mitogen activated protein kinases, potentiates the cellular response to low epidermal growth factor concentrations and increases G1/S progression. The molecular mechanism of ERK1/2 activation in WNK2 depleted cells lies downstream of the Raf kinases and involves MEK1 phosphorylation at serine 298, which is linked to the upregulation of MEK1 activity toward ERK1/2. It was further found that WNK2 depletion decreases RhoA activation so that GTP loading of Rac1 is promoted, leading to stimulation of the Rac1 effector PAK1, which is the kinase responsible for subsequent phosphorylation of MEK1 at serine 298. These results suggest that WNK2 controls a RhoA mediated cross talk mechanism that regulates the efficiency with which ERK1/2 can be activated upon growth factor stimulation, indicating that oncogenic loss of WNK2 expression can contribute to the self sufficiency in growth signals of tumour cells. Recently, epigenetic methylation of WNK2 promoter region was reported in a large percentage of human gliomas, substantiating a role for this kinase as a cell growth suppressor. Finally, WNK2 may also be involved in the regulation of intracellular traffic, since the overexpressed protein was found to localise to a subpopulation of RhoB positive endosomes and induce scattering of the Golgi and trans Golgi network structures. This suggest a role of WNK2 in vesicular traffic and future work on its effect on growth factor receptor or ion channel transport should shed further light on how WNK2 can act as a tumour suppressor.
