Author(s):
Barroso, Maria Madalena H. Serras Vicente 
Date: 2009
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10451/1516
Origin: Repositório da Universidade de Lisboa
Subject(s): Biologia molecular; Óxido nítrico; Doença vascular; Técnicas biológicas; Teses de mestrado
Description
Tese de mestrado, Biologia (Biologia Molecular Humana), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências A doença vascular, nos países ditos industrializados, constitui a principal causa de mortalidade e morbilidade. Recentemente foi sugerido o possível envolvimento de alterações epigenéticas na toxicidade vascular observada em situações de hiper-homocisteinémia (HHcy), promovidas pela acumulação intracelular do precursor da homocisteína: a S-adenosil-homocisteína (SAH). No presente estudo procurou esclarecer-se o efeito da acumulação intracelular de SAH na expressão dos genes envolvidos na biodisponibilidade da principal molécula anti-trombótica endógena - o óxido nítrico (NO). Foi estudada a expressão da enzima responsável pela síntese de NO, a sintase de óxido nítrico endotelial (eNOS) e das enzimas envolvidas no metabolismo do seu inibidor endógeno - a dimetilarginina assimétrica. Foi ainda analisada a proteína responsável pela inibição da eNOS, essencialmente ao nível cavéolar - Caveolin-1 (Cav-1). Como modelo de estudo foram utilizadas culturas de células endoteliais humanas isoladas da veia de cordão umbilical, nas quais a acumulação intracelular de SAH foi conseguida através da manipulação do metabolismo da homocisteína. Os resultados obtidos mostram que o estado de hipometilação induzido pela acumulação de SAH foi responsável pelo aumento da transcrição de todos os genes estudados. No entanto, ao nível da tradução, foram observadas alterações significativas apenas para a expressão das proteínas: eNOS e Cav-1, nomeadamente, uma diminuição e aumento, respectivamente. O contraste entre a diminuição da expressão de eNOS e o aumento de Cav-1 sugere que a diminuição da produção de NO observada poderá resultar de um aumento de Cav-1, a qual, para além de exercer um efeito inibitório sobre a eNOS ao nível membranar e citosólico, poderá ainda contribuir para uma degradação ou translocação subcelular da enzima. Assim, o mecanismo proposto poderá contribuir para a elucidação do binómio HHcy-doença vascular, e futuramente, possibilitar o desenvolvimento estratégias terapêutico-preventivas que permitam a redução da incidência da principal causa de morte, a doença cardiovascular. Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality and morbility in the developed countries. Recently, the involvement of epigenetic modifications in the vascular toxicity has been suggested in hiperhomocysteinemia situations, as a result of the accumulation of homocysteine's precursor, S-adenosylhomocysteine (SAH). The central aim of this study was to elucidate whether SAH accumulation, through an epigenetic mechanism mediated by cellular hypomethylation, alters the expression patterns of genes related to the availability of the most important endogenous anti-trombotic molecule nitric oxide (NO). With this purpose we studied the expression of gene products involved either in NO synthesis (endothelial nitric oxide synthase, eNOS) or in the metabolism of its endogenous inhibitor - asymmetric dimethylarginine (ADMA). In addition, we studied Caveolin-1 (Cav-1) expression, which is responsible for eNOS inhibition essentially at caveola's level. Cultured human umbilical vein endothelial cells were used to assess the impact of SAH accumulation on NO production. Intracellular SAH accumulation was promoted by homocysteine's metabolism manipulation. The results demonstrate that SAH accumulation was responsible for increased transcription rates for all of the target genes. However, at translation level, only two proteins showed significant alterations, namely eNOS and Cav-1, whose expression was decreased and increased, respectively, relative to control samples. The disparity between eNOS and Cav-1 expression pattern seems to be determinant for a reduction of NO biosynthesis. We propose that Cav-1 could not only inhibit eNOS at the membranar and cytosolic level, but also induce sub-cellular translocation or degradation. In the future, the proposed mechanism may contribute for the elucidation of the connection between HHcy and vascular disease, further allowing the development of new therapies and the implementation of prevention strategies to reduce the major cause of death, the cardiovascular diseases.
