Autor(es):
Nolasco, Madalena Tavares Festas de Sousa 
Data: 2009
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/1515
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Biologia molecular; Deficiência hereditária de GPI; Técnicas biológicas; Teses de mestrado
Descrição
Tese de mestrado, Biologia (Biologia Molecular e Genética), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências Inherited glycosylphosphatidylinositol (GPI) deficiency (IGD), characterized by thrombosis and epilepsy, but not hemolysis, is caused by a mutation that disrupts binding of the transcription factor (TF) Sp1 to the core promoter of the mannosyltransferaseencoding gene PIGM. The level of GPI expression in affected children varies between cells of the same and different tissues. While GPI expression in erythrocytes is close to normal, granulocytes are severely deficient, suggesting erythroid-specific regulation of PIGM. To investigate whether this difference could be due to transcriptional control of this housekeeping gene by the tissue-specific TF GATA-1, bioinformatic analysis of the PIGM promoter was carried out and revealed 3 putative GATA binding sites. Electromobility shift assays with nuclear extracts from K562, and anti-GATA-1 antibody confirmed that GATA-1 binds to those sequences. In chromatin immune-precipitation assays, precipitation of nuclear extract of K562 cells with anti-GATA-1 antibody resulted in enrichment of DNA sequences containing the binding sites, indicating that GATA-1 binding to the PIGM promoter occurs in vivo. The functional effect of GATA-1 was tested by means of reporter assays using HeLa cells. Constructs, which were wild type and mutant for the Sp1 site mutation were used. Co-transfection of reporter plasmids with a GATA-1 containing plasmid enhanced Luciferase activity, an effect which was reduced when the GATA sites were absent, as in the short constructs, but not when totally abolished by site-directed mutagenesis. Comparison of the wild type and mutant construct activities revealed that the effect of GATA-1 on this promoter region is more potent by the presence on an intact Sp1 site. Our results show that GATA-1 enhances transcriptional activity of PIGM promoter both in a Sp1-dependent and -independent manner. In IGD, the latter mechanism ensures adequate transcription of PIGM, GPI biosynthesis and expression of CD59 in erythroid cells and thus lack of intravascular hemolysis and anemia. A deficiência hereditária de glicosilfosfatidilinositol (IGD) é causada pela presença de uma transversão C>G na posição -270 do promotor do gene da manosiltransferase-I PIGM. Esta mutação leva à disrupção do local de reconhecimento do factor de transcrição (FT) Sp1 no promotor de PIGM, o que se traduz na biossíntese deficiente da âncora GPI. Na IGD, o nível de expressão de PIGM varia entre as diversas linhagens hematopoiéticas - enquanto se apresenta praticamente normal em eritrócitos, é altamente afectado em granulócitos, o que sugere a ocorrência de uma regulação transcricional específica de linhagem neste gene. Para testar a hipótese do FT específico da linhagem eritróide/megacariocítica, GATA-1, ser o regulador crítico desta expressão, recorreu-se à análise bioinformática do promotor em estudo e identificaram-se 3 locais GATA-1 putativos. Ensaios de alteração da mobilidade electroforética (EMSA), utilizando extractos nucleares de células eritroleucémicas K562 e um anticorpo anti- GATA-1, confirmaram a ligação de GATA-1 às sequências esperadas in vitro. Ensaios de imunoprecipitação de cromatina (ChIP), recorrendo a um anticorpo anti-GATA-1, resultaram num enriquecimento da precipitação destas sequências, indicando que este se liga também in vivo. Ensaios repórter com a Luciferase, realizados em células HeLa, revelaram um aumento da actividade transcricional na presença de GATA-1, permitindo confirmar o efeito activador deste FT na sequência promotora. Os resultados demonstraram que GATA-1 activa a transcrição de PIGM de forma dependente e independente de Sp1. Na IGD, este último mecanismo assegura a transcrição adequada de PIGM, a biossíntese completa de GPI e a expressão de CD59 nos eritrócitos, explicando também a ausência de hemólise e anemia.
