Autor(es):
Tempera, Carolina Isabel Glória, 1990- 
Data: 2013
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10451/10819
Origem: Repositório da Universidade de Lisboa
Assunto(s): Plasmodium; Malária; Resistência a antimaláricos; Teses de mestrado - 2013
Descrição
Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013 Malaria is caused by a parasite of the genus Plasmodium and remains the most important parasitic disease. The emergence of Plasmodium falciparum parasites resistant to all known antimalarial drugs is of major concern. New antimalarial drugs are needed, not only a drug that overcome the undesirable side effects of current antimalarial drugs but new highly active ones against the asexual stages, as well as, drugs that could also eliminate the transmissible sexual form of the parasite to the mosquito. To test the susceptibility of the parasite to drugs a variety of sensitivity assays can be used to screen new compounds, such as: hypoxanthine incorporation, ELISA based assays like pLDH and HRP2, fluorometric and flow cytometric assays. Recently, a novel flow cytometric sensitivity assay based on hemozoin detection was described. Using this novel sensitivity assay new antimalarial compounds were screened at 1 and 3 μM. The SYBR green DNA staining assay and the HRP2 were also perfomed as mean of comparison. Results showed that none of the tested compounds presented inhibitory activity against P. falciparum strains 3D7 and Dd2 at 1 μM, independently of the method used. Only one of the compounds showed more than 50% inhibition at 3μM. The flow cytometric hemozoin detection method was also assessed for its potential to detect gametocytes. Gametocyte may have a different depolarizing profile, based on the underlying hemozoin distribution. Thus, we further investigated if they could be distinguished from other parasitie forms based on their higher degree of depolarization. A culture enriched in gametocytes was FACS sorted by selecting the higher depolarizing population. Results showed that gametocytes were selectively present only in the high depolarizing population and not in the middle and non-depolarizing events. Therefore, this recently described sensitivity assay based on hemozoin detection can be used as a novel approach to screen for new antimalarial drugs. This approach has as major advantages the fact that results can be obtained in only 24 h of incubation and no additional reagents or additional incubation times are required. Another important characteristic of this method is that it might be able to detect gametocytes based on the particular hemozoin distribution in these forms, which can lead to the use of this method to test antimalarial transmission blocking drugs. A malária é uma doença que segundo os mais recentes dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) foi responsável por cerca de 660 000 mortes e 219 milhões de casos em 2010. É a doença parasitária que mais mortes causa sendo a região mais afetada por esta doença a África subsariana, e com uma maior incidência em crianças até aos 5 anos de idade. A malária é causada pelo parasita do género Plasmodium. As cinco espécies que podem causar doença no humano são: P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae e P. knowlesi. No entanto P. falciparum é a espécie responsável pelo maior número de casos e mortes por malária sendo também o que pode levar a uma maior severidade da doença. A malária manifesta-se por períodos de febres altas e calafrios, mal-estar generalizado, torpor e dor de cabeça, naúsea e dor abdominal, por vezes até vómitos e diarreia. No caso de doença severa esta implica anemia severa, malária cerebral, síndrome de dificuldade respiratória aguda, insuficiência renal e nos casos mais graves a morte. Segundo estes factos, a maária é uma doença que levanta preocupação e tem impacto a nível mundial. Isto porque, por várias circunstâncias se pensou que estaríamos no caminho da erradicação da doença e no entanto, apesar de o número de casos e mortes ter diminuído na última década, esta continua a afetar milhões de indivíduos. Hoje em dia, um dos maiores problemas face a esta doença prende-se com o facto de P. falciparum já ter apresentado resistência a todos os fármacos utilizados no tratamento da doença. Entre os antimaláricos já usados encontram-se a quinina, a cloroquina, a primaquina, a pirimetamina conjugada com a sulfadoxina, a mefloquina entre outros. No entanto, as atuais directrizes para o tratamento da malária correspondem a terapias de combinação com recurso a derivados da artemisinina (“Artemisinin-based combination therapies” – ACTs). Alguns exemplos destas combinações são: artesunato combinado com amodiaquina, artesunato com mefloquina, arteméter e lumefantrina, entre outros. O principal objectivo detas terapias é eliminar as formas do parasita que circulam no sangue, pois é este estadio que conduz à manifestação da doença. Plasmodium é um parasita que apresenta um ciclo de vida complexo. É transmitido ao humano através da picada de um mosquito infectado femea do género Anopheles. Durante a picada, o parasita que existe nas glândulas salivares do mosquito é injetado na corrente sanguínea do humano, e dirige-se até ao fígado. No fígado vários parasitas vão invadir os hepatócitos, dentro dos quais maturam e replicam antes de serem libertados novamente na corrente sanguínea. Esta fase hepática é assintomática. Uma segunda vez na corrente sanguínea, os parasitas vão invadir eritrócitos dentro dos quais vão maturar e replicar antes de lisarem o eritrócito, libertando novos parasitas para invadir novos eritrócitos. Uma vez dentro de um eritrócito, um parasita segue um ciclo de maturação que compreende as seguintas formas: forma de anel, trofozoíto, e esquizonte. No final, irá libertar vários merozoítos. No entanto, ocasionalmente alguns destes merozoitos, quanto invadem um eritrócito vão originar formas sexuadas do parasita, os gametócitos. Os gametócitos apresentamse sob a forma de percursores masculinos e femininos, e são estas formas que quando em circulação podem ser ingeridas por um mosquito durante uma nova picada. Após ingeridas pelo mosquito, estas formas vão recombinar genéticamente, dando origem a uma nova descendência que será novamente transmitida ao humano, recomeçando este ciclo. Colocam-se assim dois grandes objectivos à erradicação da malária: (i) um passa pelo desenvolvimento de novos agentes antimaláricos, devido à evidênca de resistência de P. falciparum a todos os actuais antimaláricos, incluindo os derivados da artemisinina que compreendem as atuais diretrizes de tratemento da doença; (ii) o outro prende-se com a eliminação das formas sexuadas do parasita em circulação no hospedeiro, pois eliminando estas formas, quebra-se o ciclo de transmissão hospedeiro-vector. Para a contínua pesquisa de novos compostos antimaláricos é necessário ensaios que detectem a sensibilidade dos parasitas aos diferentes fármacos. Os ensaios de sensibilidade actualmente existentes são: (i) o teste de microscópia da OMS; (ii) o teste por incorporação de hipoxantina; os testes baseados na detecção de anticorpos (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay – ELISA) para quantificação de proteinas do parasita como a (iii) lactase desidrogenase (Parasite lactate dehydrogenase – pLDH e a (iv) proteina rica em histidina 2 (Histidine Rich Protein - HRP2); testes baseados na deteção do DNA do parasita por (v) ensaios fluorométricos e por (vi) citometria de fluxo. No entanto, como até agora não existe o teste de sensibilidade ideal, e devido a várias limitações de cada ensaio, novos ensaios são desenvolvidos. Um dos mais recentes baseia-se na deteção de hemozoina por citometria de fluxo. A hemozoína, também denominada pigmento malárico, é um bioproduto que resulta da destoxificação de heme livre produzido após a metabolização da hemoglobolina pelo parasita, e acumula-se no interior do eritrócito durante a maturação do mesmo. A hemozoína é um cristal com propriedades birefringentes que levam à despolarização da luz. Devido a esta propriedade, foi desenvolvido um ensaio de citometria de fluxo que detecta a hemozoína presente no interior de eritrócitos infectados. Assim, com o acumular de hemozoina ao longo do tempo, a deteção dos parasitas vai aumentando, havendo um maior número de eventos a despolarizar entre as 24h-30h de um primeiro ciclo de maturação, altura em que a maioria dos parasitas se apresenta como esquizonte, o estadio que também tem maior quantidade de hemozoína. Este ensaio permitiu detectar a sensibilidade de P.falciparum a vários antimaláricos e foi agora utilizado para testar a sensibilidade do parasita a novos antimaláricos cedidos pelo grupo do Professor Doutor Rui Moreira da Faculdade de Farmácia. A pesquisa da actividade dos novos compostos (“screening”) a 1 μM e a 3 μM foi realizada em duas estirpes de laboratório de P. flaciparum, a 3D7 (sensível à cloroquina) e a Dd2 (resintente à cloroquina). Após incubar a estirpe Dd2 em presença dos vários compostos, a sua inibição foi avaliada por citometria de fluxo, utilizando o ensaio da deteção de hemozoína e pelo ensasio da deteção de parasitas cujo DNA foi corado com SYBR green. Os resultados de ambos os ensaios demonstraram que nenhum dos 18 compostos testados a uma concentração de 1 μM levou à inibição do parasita. Com a estirpe 3D7 foram testados 24 novos compostos, não só utilizando os dois médotos de citometria de fluxo já referidos como também através de HRP2-ELISA. Os resultados demonstaram que independentemente do ensaio utilizado nenhum dos novos compostos apresentou actividade inibitória a 1 μM. Porém os compostos foram testados a uma concentração mais elevada, e a 3 μM um dos compostos demonstrou actividade inibitória (o composto 321). Determinou-se a concentração à qual este composto inibe 50 % do crescimento do parasita (CI50) de acordo com os três ensaios para detectar a sensibilidade do parasita obtendo-se um valor à cerca de 2 μM. No entanto, esta concentração é demasiado alta para o composto poder ser posteriormente testado como agente antimalárico na fase sanguínea do parasita, pois os actuais antimaláricos actuam na ordem nos nanomolar (nM). Para erradiacar a malária, a eliminação de gametócitos é um dos principais objectivos, de modo a quebrar o ciclo de transmissão da doença. Porém, existem muito poucos tratamentos que inibam estas formas sexuadas, e por isso é necessário continuar a investigar novos fármacos que actuem com mais impacto neste estadio do parasita. Para tal, uma vez mais são necessários ensaios que possam averiguar a sensibilidade dos gametócitos a diversos fármacos. No entanto, não exitem tantos ensaios para tal, como os que existem para testar a sensibilidade dos estadios assexuados. Uma vez que os gametócitos também apresentam hemozoína no seu interior, pressupôs-se que o ensaio de sensibilidade baseado na deteção de hemozoína permitisse também detectar gametócitos, retirando partido do facto de a hemozoína acumulada nos gametócitos apresentar-se de forma diferente nos esquizontes, pois ocorre sob a forma de vários e pequenos fragmentos ao contrário de um único e grande aglumerado. Assim, colocou-se a hipótese de se detectar os gametócitos por citometria de fluxo, e que estes corresponderiam a uma diferente população de acordo com a despolarização da sua hemozoína. Para corroborar esta ideia, estabeleceu-se a diferenciação de gametócitos a partir de culturas contínuas e posteriormente, através de análise por citometria de fluxo, os eventos da cultura de gametócitos foram separados (“sorting”) com base na sua depolarização. Partindo do princípio que os gametócitos têm mais cristais, estes podem levar a uma maior quantidade de luz a depolarizar, logo iriam localizar-se num nível de despolarização mais elevado do que os esquizontes. Assim, três populações foram separadas do seguinte modo: (i) população que não despolariza; (ii) população que despolariza a um nível médio (semelhante ao nivel de despolarização de esquizontes) e (iii) população a um nível mais elevado de despolarização. Após observação de cada uma das populações por microscopia, constatou-se que dos eventos adquiridos, os gametócitos só se encontravam na população cuja despolarização era a mais elevada. Com este recente ensaio baseado na deteção de hemozoína foi então possivel testar a actividade inibitória de novos compostos antimaláricos, obtendo as mesmas conclusões que outros dois métodos utilizados em paralelo. Este ensaio poderá assim ser utilizado no rastreio da actividade de novos compostos, como alternativa aos existentes actualmente, aos quais, há resistências desenvolvidas pelo parasita assim como o facto de conduzirem a efeitos secundários indesejáveis. Em relação aos outros ensaios de sensibilidade, este método apresenta-se como um método rápido de obter resultados (24h) e em tempo real, sem a necessidade de adição de reagentes ou tempos adicionais de incubação com reagentes. Este método permitiu ainda detetar uma população específica do parasita, os gametócitos, os quais representam um dos principais alvos para a eliminação da malária. Assim, este método poderá também ser investigado como ensaio de sensibilidade dirigido a gametócitos.
