Autor(es):
Roque, Cláudio 
; Beato, Sílvia ; Mauricio, Isabel ; Belo, Silvana
Data: 2013
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10400.11/2340
Origem: Repositório Científico do Instituto Politécnico de Castelo Branco
Assunto(s): F. hepatica; Fasciolose; PCR; Amplificação das regiões ITS1 e ITS2; Sequenciação; Rede filogenética; Identificação de um novo haplótipo
Descrição
F. hepatica é o agente etiológico da Fasciolose humana/animal, e tem a capacidade de parasitar diversas espécies animais, principalmente herbívoros e omnívoros (ovinos, bovinos, caprinos, etc.) onde pode ser encontrado no fígado e canais biliares, tendo também a capacidade, de acidentalmente infetar o Homem. Este parasita apresenta uma distribuição cosmopolita sendo mais frequente em regiões pantanosas sujeitas a inundações periódicas.
Foi efetuada a extração de DNA de um exemplar de F. hepatica obtido no matadouro de Pedrogão Grande, através do método manual de fenol-clorofórmio. As regiões ribossomais intergénicas transcritas ITS1 e ITS2 foram amplificadas em duas reações separadas, com os primers BD1/4S (Bowles, et al., 1993c) e Dd58SF1/Dd28SR1 (Sharroks, 1994), respetivamente. Os produtos de amplificação das reações foram purificados com o kit “QIAquick PCR purification kit” e sequenciados pela empresa STAB VIDA (Portugal), através do método de Sanger. No final procedeu-se ao tratamento e análise filogenética das sequências obtidas através de software apropriado, culminando com a criação de redes filogenéticas pelo programa SplitsTree4, usando distâncias calculadas através do parâmetro Kimura-2 no algoritmo Neighbor-Net.
Após se efetuar a amplificação regiões alvo (ITS1 e ITS2) e respetiva análise filogenética verificou-se que estas eram diferentes de todas as que estavam descritas na base de dados do GenBank. A região ITS1 do exemplar estudado está mais próxima filogeneticamente de amostras do continente asiático (AJ628432, AJ628431, EF612469 e EF612468), do continente africano (EF612467 e EF198867) e do continente americano (AJ243016), com um único local polimórfico de diferença entre as sequências referidas e a sequência estudada. A região ITS2 estava próxima filogeneticamente de sequências descritas um pouco por todo o mundo, apresentando 2 locais polimórficos em relação às sequências descritas na base de dados.
Este será portanto um novo haplótipo de ITS1 e ITS2 para F. hepatica e a primeira sequência obtida desta região para esta espécie em Portugal.
