Author(s):
Monteiro, João Luís Cardoso Dias 
Date: 2013
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10316/25225
Origin: Estudo Geral - Universidade de Coimbra
Subject(s): Sangue do cordão umbelical; Células estaminais
Document details
Reprogramming strategies for cord blood cd34+ cells with different mitochondria...
Description
Células pluripotentes induzidas são uma alternativa importante de forma a evitar o uso de células embrionárias. Ao controlar a remodelação epigenética de uma célula somatica é possível reestabelecer o fenótipo embrionário. Deste modo esta tecnologia (iPSC – induced pluripotent stem cell) poderá ser um grande passo no campo da medicina regenerativa e em monitorização de testes de toxicidade. No entanto a eficiência limitada na geração de iPSC e algumas diferenças em relação ao fenótipo e função comparado com as células estaminais embrionárias (ESCs – embryonic stem cells) são grandes obstáculos aos avanços nesta área. Como a reprogramação cellular depende de vários eventos estocásticos, uma boa estratégia seria a seleção de uma população imatura, como as CD34+ derivadas a partir do sangue do cordão umbilical, uma vez que estas células estão mais próximas da pluripotência do que células diferenciadas. Para seleção de diferentes sub-populações dentro das CD34+ as técnicas tradicionais de sorting requerem a combinação de vários anticorpos, são demoradas e requerem técnicos competentes. De forma a ultrapassar estes problemas exploramos um novo método para selecionar uma população primitiva das células CD34+ do sangue do cordão umbilical baseado na captação de uma sonda mitocondrial TMRM (Tetramethylrhodamine, methyl ester). Nós comparamos as eficiências de reprogramação das populações com elevada e baixa captação de TMRM depois de infeção com um vector lentiviral que continha os 4 factores do Yamanaka. Adicionalmente os níveis de oxigénio durante a reprogramação foram modulados usando hipoxia e antimicina A. Fomos capazes de concluir que a população CD34+ do sangue do cordão umbilical com menor captação do TMRM foi capaz de conseguir atingir melhores eficiências em normoxia e com maior expressão dos genes pluripotentes principais (Oct4, Sox2 e Nanog). Ambas as populações foram caracterizadas fenotipicamente permitindo-nos validar o nosso método de sorting para selecionar células imaturas. Após a reprogramação em hipoxia ambas as populações demonstraram um comportamento similar. No entanto a população com menor captação do TMRM tinha níveis mais elevados de expressão dos genes pluripotentes principais. O tratamento com antimicina A combinado com a hipoxia permitiu-nos não só obter eficiências de reprogramação semelhantes em ambas as populações como também equalizar os níveis de expressão de Oct4, Sox2 e Nanog. Em conclusão, fomos capazes de criar um novo método para selecionar as células CD34+ do sangue do cordão umbilical mais adequadas para estudos de reprogramação reduzindo o número de anticorpos e tempo gasto. Desta forma não só reduzir-se-á a complexidade do método como também permitirá uma redução dos 8 níveis de stress impostos às células e um procedimento de sorting mais eficiente. Adicionalmente existe ainda espaço para melhoramentos futuros usando agentes moduladores como a hipoxia e a antimicina A. Esperamos que o nosso trabalho venha a contribuir para a seleção de uma população celular ideal para reprogramação e desta forma reforçar o processo de reprogramação.
Células pluripotentes induzidas são uma alternativa importante de forma a evitar o uso de células embrionárias. Ao controlar a remodelação epigenética de uma célula somatica é possível reestabelecer o fenótipo embrionário. Deste modo esta tecnologia (iPSC – induced pluripotent stem cell) poderá ser um grande passo no campo da medicina regenerativa e em monitorização de testes de toxicidade. No entanto a eficiência limitada na geração de iPSC e algumas diferenças em relação ao fenótipo e função comparado com as células estaminais embrionárias (ESCs – embryonic stem cells) são grandes obstáculos aos avanços nesta área. Como a reprogramação cellular depende de vários eventos estocásticos, uma boa estratégia seria a seleção de uma população imatura, como as CD34+ derivadas a partir do sangue do cordão umbilical, uma vez que estas células estão mais próximas da pluripotência do que células diferenciadas. Para seleção de diferentes sub-populações dentro das CD34+ as técnicas tradicionais de sorting requerem a combinação de vários anticorpos, são demoradas e requerem técnicos competentes. De forma a ultrapassar estes problemas exploramos um novo método para selecionar uma população primitiva das células CD34+ do sangue do cordão umbilical baseado na captação de uma sonda mitocondrial TMRM (Tetramethylrhodamine, methyl ester). Nós comparamos as eficiências de reprogramação das populações com elevada e baixa captação de TMRM depois de infeção com um vector lentiviral que continha os 4 factores do Yamanaka. Adicionalmente os níveis de oxigénio durante a reprogramação foram modulados usando hipoxia e antimicina A. Fomos capazes de concluir que a população CD34+ do sangue do cordão umbilical com menor captação do TMRM foi capaz de conseguir atingir melhores eficiências em normoxia e com maior expressão dos genes pluripotentes principais (Oct4, Sox2 e Nanog). Ambas as populações foram caracterizadas fenotipicamente permitindo-nos validar o nosso método de sorting para selecionar células imaturas. Após a reprogramação em hipoxia ambas as populações demonstraram um comportamento similar. No entanto a população com menor captação do TMRM tinha níveis mais elevados de expressão dos genes pluripotentes principais. O tratamento com antimicina A combinado com a hipoxia permitiu-nos não só obter eficiências de reprogramação semelhantes em ambas as populações como também equalizar os níveis de expressão de Oct4, Sox2 e Nanog. Em conclusão, fomos capazes de criar um novo método para selecionar as células CD34+ do sangue do cordão umbilical mais adequadas para estudos de reprogramação reduzindo o número de anticorpos e tempo gasto. Desta forma não só reduzir-se-á a complexidade do método como também permitirá uma redução dos 8 níveis de stress impostos às células e um procedimento de sorting mais eficiente. Adicionalmente existe ainda espaço para melhoramentos futuros usando agentes moduladores como a hipoxia e a antimicina A. Esperamos que o nosso trabalho venha a contribuir para a seleção de uma população celular ideal para reprogramação e desta forma reforçar o processo de reprogramação.
Document Type
Master Thesis
Language English
Advisor(s) Neves, Ricardo
Language English
Advisor(s) Neves, Ricardo
| Financiadores do RCAAP | |||||||
|
|
|
|
|
|
||