Author(s):
Francisco, Joana Filipa Henriques 
Date: 2012
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10316/25144
Origin: Estudo Geral - Universidade de Coimbra
Subject(s): Anfetamina; Íleo isolado de rato; Contracção; 5-HT; TAAR1
Description
O abuso da anfetamina está associado a graves efeitos neurológicos, psiquiátricos
e cardiovasculares. No entanto, os efeitos no altamente inervado tracto gastrointestinal
são imprevisíveis. A anfetamina está estrutural e funcionalmente relacionada com as
aminas vestigiais para-tiramina. As aminas vestigiais e as anfetaminas têm a
habilidade de inibir a libertação extracelular de transmissores e/ou estimular o efluxo
de transmissores a partir de reservas intracelulares, incluindo a 5-hidroxitriptamina (5-
HT). Foi recentemente descrito que as anfetaminas e as aminas vestigiais são
agonistas potentes de um novo receptor acoplado à proteína G, que estimula a
produção de AMPc, o trace amine-associated receptor 1 (TAAR1). Foi também
sugerido que alguns dos efeitos da anfetamina possam ser mediados, em parte, por
esse receptor. De forma a entender o mecanismo envolvido nos efeitos adversos da
anfetamina a nível gastrointestinal, o objectivo deste trabalho foi caracterizar
farmacologicamente o receptor que medeia a resposta contráctil do íleo isolado de rato
à anfetamina.
Ratos Wistar machos foram sacrificados e o íleo removido e preparado para
contracções isométricas de curvas concentração-resposta (CR) de adições
independentes à 5-HT (0,1 μM – 60 μM), à tiramina e à anfetamina (1 μM – 6000 μM).
Após a adição de 100 μM de acetilcolina (de forma a comparar os resultados),
antagonistas de diferentes receptores foram adicionados ao banho de órgãos 15
minutos antes de cada dose da curva CR. Em todas as experiências foram utilizados
segmentos controlo, aos quais se adicionou apenas o solvente apropriado para cada
composto. Os segmentos de íleo foram também utilizados para cortes histológicos e
técnicas de imunohistoquímica de forma a estuder a imunoreactividade de subtipos de
receptores 5-HT. Foram ainda realizados estudos in vivo com o intuito de estudar o
comportamento do rato após a administração de anfetamina e a sua neurotoxicidade e
as possíveis consequências de tal administração na função intestinal, isto é, na
resposta contráctil do íleo isolado de rato. Para tal, foi administrado 15 mg/Kg de
solução salina de anfetamina aos animais ensaio e solução salina aos animais
controlo. A administração foi via intraperitoneal. O comportamento assim como a
temperatura foram registadas. Os animais foram sacrificados 24 horas após a
administração e recolheu-se estriado, para quantificação dos níveis de monoaminas, e
íleo, para estudos funcionais e imunohistoquímicos. Os estudos funcionais consistiram na realização de curvas CR de adições independentes à anfetamina e à 5-HT na
ausência de qualquer antagonista. As diferenças estatísticas foram analisadas pelo
teste t de Student e ANOVA seguido do teste de comparações múltiplas de Dunnett ou
Tukey.
Tanto a anfetamina como a tiramina induziram contracções dependentes da
concentração no íleo de rato com idêntica actividade intrínseca e potência (anfetamina:
Emáx de 10,51 ± 1,35 mN; pEC50 de 4,64 ± 0,19, n=25; tiramina: Emáx de 11,54 ± 1,65
mN; pEC50 de 4,09 ± 0,32, n=13). As curvas CR à anfetamina não foram
significativamente alteradas pela atropina (1 μM) ou mepiramina (1 μM), excluindo o
envolvimento de receptores muscarínicos e da histamina H1. No entanto, a cetanserina
(1 μM), um antagonista dos receptores 5-HT2A/2C e o RS 127445 (0,05 μM), um
antagonista selectivo dos receptores 5-HT2B, alteraram de forma significativa a curva
CR à anfetamina. De facto, a ritanserina (1 μM), um antagonista não selectivo dos
receptores 5-HT2A/2B/2C, aboliu completamente a contracção intestinal induzida pela
anfetamina, apontando para o envolvimento da 5-HT2 no efeito provocado pela
anfetamina. Alterações semelhantes e significativas foram, igualmente, observadas
nas curvas CR à 5-HT na presença de cetanserina, RS 127445 e ritanserina. Além
disso, os estudos imunohistoquímicos revelaram imunoreactividade para os receptores
5-HT2A e 5-HT2B nas células ganglionares do plexo mientérico e submucoso, mas não
nas células musculares lisas das camadas longitudinal e circular. Além disso, o
recentemente descrito antagonista selectivo do TAAR1, N-(3-etoxi-fenil)-4-pirrolidin-1- il-3-trifluorometil-benzamida (EPPTB), 5 μM, alterou significativamente (com redução
do Emáx) as curvas CR à anfetamina e à tiramina, sugerindo igualmente o recrutamento
do TAAR1. Uma vez que a reserpina (100 μM) aboliu completamente a contracção
intestinal induzida pela anfetamina, e que cerca de 90% da 5-HT é sintetizada,
armazenada e libertada essencialmente por células enterocromafins no intestino,
propomos que a anfetamina possa desencadear a libertação de monoaminas a partir
das células enterocromafins, embora mais estudos serão necessário para provar,
definitivamente o envolvimentos do TAAR1 através da sua localização celular.
Relativamente aos estudos funcionais realizados com os íleos dos ratos controlo e
sujeitos a 15 mg/Kg de anfetamina, não foram observadas alterações estatisticamente
significativas nas curvas CR à anfetamina e à 5-HT, demonstrando não haver
alterações relevantes na função intestinal. Os ratos que foram administrados com
anfetamina ficaram hipertérmicos durante cerca de 90 minutos e mostraram comportamentos estereotipados. Relativamente à quantificação dos níveis de
monoaminas, só a dopamina diminui de forma significativa, demonstrando alguma
neurotoxicidade nos ratos sujeito ao fármaco após 24 horas.
Em conclusão, este estudo demonstra, pela primeira vez, que tanto a 5-HT como
os trace amine-associatede receptors contribuem para a resposta contráctil do íleo de
rato à anfetamina. Amphetamine (AMPH) misuse is associated with serious neurologic, psychiatric
and cardiovascular adverse effects. However, its effects on the highly innervated
gastrointestinal tract are unpredictable. AMPH is structurally and functionally related to
the trace amine para-tyramine. Trace amines and amphetamines have the ability to
inhibit the clearance of extracellular transmitter and/or stimulate the efflux of transmitter
from intracellular stores, including 5-hydroxytryptamine (5-HT). It was recently reported
that amphetamines and trace amines are potent agonists of a novel G protein-coupled
receptor that stimulates the production of cAMP, the trace-amine-associated receptor 1
(TAAR1). It was also suggested that some effects of amphetamines may be mediated
in part by this receptor. In order to further understand the mechanism involved in the
gastrointestinal adverse effects of AMPH, the aim of this study was to characterize
pharmacologically the receptor mediating the contractile response of the rat isolated
ileum to AMPH.
Male Wistar rats were sacrificed and the ileum was removed and prepared for
isometric contractile concentration-response (CR) curves (not cumulative) for AMPH,
tyramine (1 μM – 6000 μM) and 5-HT (0.1 μM – 60 μM). After 100 μM acetylcholine (in
order to compare the results), antagonists of different receptors were added to the
organ bath 15 min before each dose of the CR curve. In each assay, control segments
were used with the appropriate solvent of each drug. Ileum segments were also used
for histological section and immunohistochemical techniques to study the
immunoreactivities of 5-HT receptors subtypes. Studies have been conducted in vivo in
order to study the behavior of rats and AMPH neurotoxicity after administration of
AMPH, and also the possible consequences of such administration in the intestinal function (contractile response of rat ileum). A group of rats were injected
intraperitoneally with 15 mg/Kg of AMPH and the control group of rats were injected
with a saline solution. The behavior and the temperature were recorded. The animals
were sacrificed 24 hours after the administration and the striatum was collected to
quantify monoamines levels. The ileum was also collected for functional and
immunohistochemical studies. The ileum was prepared for isometric contractile CR
curves (not cumulative) for AMPH and 5-HT in the absence of antagonists. Statistical
differences were evaluated by Student´s t test and ANOVA with Dunnett’s or Tukey's
multiple comparison test. Both AMPH and tyramine caused concentration-dependent ileum contractions with
similar intrinsic activity and potency (AMPH: Emax of 10.51 ± 1.35 mN; pEC50 of 4.64 ±
0.19, n=25; tyramine: Emax of 11.54 ± 1.65 mN; pEC50 of 4.09 ± 0.32, n=13). AMPH CR
curves were not significantly altered by atropine (1 μM), or mepyramine (1 μM)
excluding the involvement of muscarinic and H1 histamine receptors on AMPH effect.
However, ketanserin (1 μM) a 5-HT2A/2C antagonist and RS 127445 (0.05 μM), a
selective 5-HT2B antagonist, changed the AMPH CR curve. In fact, ritanserin (1 μM), a
non-selective 5-HT2A/2B/2C antagonist abolished completely the AMPH-induced intestinal
contraction which points to the involvement of 5-HT2 on the AMPH effect. Significant
and similar changes on the 5-HT CR curve were also observed in the presence of
ketanserin, RS 127445 and ritanserin. Furthermore, the immunohistochemical studies
revealed immunoreactivity for the 5-HT2A and 5-HT2B receptor on ganglionary cells of
the mienteric and submucous plexus but not in the smooth muscle cells of the
longitudinal and circular layers. Moreover, the recently described TAAR1 selective
antagonist, N-(3-ethoxy-phenyl)-4-pyrrolidin-1-yl-3-trifluoromethyl-benzamide (EPPTB),
at 5 μM, significantly changed (with a reduction of the Emax) the CR curves for both
tyramine and AMPH, suggesting also the recruitment of TAAR1. Since reserpin (100
μM) abolished completely the AMPH-induced intestinal contraction, and about 90% of
serotonin is synthesized, stored and released mainly by enterochromaffin cells in the
gut, we propose that AMPH may trigger the release of the monoamine from enterochromaffin cells, though further studies are needed to definitely prove the
involvement of the TAAR1 through its cellular location. For the functional studies
performed with the ileums from control rats and rats subject to 15 mg/Kg AMPH, there
were no statistically significant changes in the AMPH and 5-HT CR curves, showing no
relevant changes in intestinal function. The rats which were subjected to AMPH
became hyperthermic for about 90 minutes and stereotyped behaviours were shown.
Regarding the results of quantification of monoamines levels, only dopamine levels
decreased significantly, showing some neurotoxicity in rats subjected to the drug after
24 hours. In conclusion, this study shows for the first time that both 5-HT and trace amineassociated
receptors contribute to the contractile response of the rat isolated ileum to
AMPH. Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
