Autor(es):
Teixeira, Paulo Alexandre Gonçalves 
Data: 2013
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10316/24646
Origem: Estudo Geral - Universidade de Coimbra
Assunto(s): Aspartic Protease; Bacteria; Legionella pneumophila; Retropepsin
Descrição
A2 family of aspartic proteases harbors mostly proteases found in retroviruses
– the retropepsins. The evolution theories regarding these proteases usually state that
these proteins are related to pepsin-like proteases from family A1 by two different
hypotheses. By the first (and usually most accepted) theory, upon infection of a
eukaryote cell by a retrovirus, the retropepsin gene would have integrated into the
host’s genome and undergone a gene duplication and fusion event, giving rise to the
first pepsin-like protease. The second theory would be that upon a virus infection of a
eukaryote cell, half of a pepsin gene would be accidentally captured by the virus,
evolving and creating the first retropepsin-like protease. Both theories neglected the
possibility that these enzymes would exist in prokaryotes. Recently, through
bioinformatics, several putative retropepsin-like and pepsin-like protease sequences
have been found in prokaryotes, which challenge the evolutionary theories presented
so far. In fact, it has already been experimentally proved the existence of the first
pepsin-like protease in a prokaryote (shewasin A) and successfully characterized as an
active aspartic protease.
For this matter, the experimental validation regarding the existence of
retropepsin-like aspartic proteases in prokaryotes needs to be addressed. Studies in
our lab have already experimentally demonstrated the presence in Rickettsia of a
highly conserved active aspartic protease with retropepsin-like signatures and
features. However, this protease may not be the only one: bioinformatics analysis
showed the existence of a large group of genes related to the Rickettsia retropepsinlike
protease in several distinct prokaryote families, all revealing conserved
retropepsin-like sequence features but with some interesting differences between
them.
The peculiar intracellular pathogen Legionella pneumophila is one of the several
bacteria species in which a retropepsin-like sequence can be found. In this study, the
putative soluble domain from the retropepsin-like protease sequence from the L.
pneumophila genome has been cloned and expressed in E. coli. The protein’s soluble
domain, termed LegRPsd, was characterized in terms of its enzymatic activity and
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oligomerization states.
The LegRPsd protein has been proved an active enzyme, with our results pointing
towards its inclusion as new member of the aspartic protease family. This protein
showed proteolytic activity towards a peptide usually used as a typical substrate for
aspartic proteases at an optimum pH of 4.0 and the activity is inhibited by about 50%
by the aspartic protease inhibitor pepstatin A. LegRPsd was also proved to undergo
auto-processing in a similar way as other retropepsin-like proteases, maturating into a
form that is no longer inhibited by pepstatin A but strongly inhibited by specific
inhibitors of HIV-1 retropepsin. The protein also showed other characteristics close to
retropepsins, like the formation of a weak homodimer structure, thought to be needed
for the formation of the active center and therefore, fundamental for activity.
Moreover, protease activity was shown to be impaired by mutation of the putative
catalytic aspartate.
Altogether, these results provide strong experimental evidences regarding the
existence of an active protease in L. pneumophila close to retropepsins not only in
terms of sequence-structure homology, but also by its biochemical properties. This
information becomes most valuable because LegRP, together with the Rickettsia
aspartic protease, stands as a strong evidence of a novel family of aspartic proteases
conserved in prokaryotes and related to retropepsins; this brings a redefinition of
evolutionary theories regarding pepsins and retropepsins, suggesting a new point of
view where these prokaryotic sequences represent the most ancestral state of
retropepsins. Not least important is that the discovery of a conserved aspartic
protease in L. pneumophila and other pathogenic bacteria raises the possibility of
finding new pathogenic pathways and consequently new therapeutic targets for these
difficult-to-treat infections as an alternative to the conventional antibiotics. A familia A2 de proteases aspárticas é constituida maioritariamente por
proteases encontradas em retrovírus – as retropepsinas. As teorias evolutivas
inerentes a estas proteases normalmente referem que estarão relacionadas com
proteases do tipo pepsina pertencentes à familia A1 de proteases aspárticas. Pela
primeira teoria (geralmente a mais aceite), durante a infeção de uma célula eucariota
por um retrovírus, o gene da retropepsina terá sofrido duplicação e fusão dando
origem à primeira protease do tipo pepsina. A segunda teoria é defende que após a
infeção de uma célula eucariota por um vírus, metade do gene de uma protease do
tipo pepsina terá sido acidentalmente capturada pelo vírus, evoluindo e criando a
primeira enzima do tipo retropepsina. No entanto, ambas as teorias negligenciam a
possibilidade de que estas enzimas pudessem existir previamente em procariotas.
Recentemente, com a descoberta de sequências putativas de proteases do tipo
retropepsina e do tipo pepsina em procariotas, estas teorias têm sido abaladas.
Efetivamente, a existência de uma protease ativa do tipo pepsina em procariotas foi
recentemente documentada e provada experimentalmente.
Por isto, é necessária a validação experimental no que toca à existencia destas
proteases aspárticas do tipo retropepsina em procariotas. Estudos no nosso
laboratório identificaram experimentalmente em Rickettsia uma protease aspártica
altamente conservada provada como sendo ativa. Esta protease partilha assinaturas e
motivos com as proteases do tipo retropepsina. No entanto, esta protease não será
provavelmente a única: estudos bioinformáticos mostram a existência de um grande
grupo de genes relacionados evolutivamente com a protease do tipo retropepsina
encontrada em Rickettsia. Estas sequências foram encontradas em várias espécies
distintas de procariotas, mas todas elas mostram características em comum com as
proteases do tipo retropepsina, mantendo, no entanto diferenças significativas entre
elas.
O patogénio intracelular Legionella pneumophila é uma das espécies bacterianas
que foram encontradas contendo estas sequências do tipo retropepsina no seu
genoma. Neste estudo, o domínio solúvel putativo de uma sequência de uma protease
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do tipo retroviral do genoma de Legionella pneumophila foi clonada e expressa em E.
coli. O domínio solúvel desta proteína, chamado LegRPsd, foi caracterizado em termos
de atividade enzimática a estados de oligomerização.
Foi demonstrado que a proteína apresenta atividade proteolítica, e os resultados
apontam para que estanova enzima pertença efectivamente à família das proteases
aspárticas. A LegRPsd tem atividade proteolítica contra um substrato típico de
proteases aspárticas a um pH ótimo de 4.0, atividade esta que é inibida em cerca de
50% na presença de pepstatina A. Foi também provado que a proteína sofre autoprocessamento,
mudando o seu perfil de inibição no sentido de perda de inibição por
pepstatina, acompanhada de um efeito inibitório por parte de inibidores da protease
retroviral do HIV-1. A proteína também revelou outras similaridades com proteases
retrovirais, como por exemplo a formação de um homodímero lábil, que se pensa ser
necessário para a formação do centro ativo, e como tal, necessário para a atividade
catalítica.
Os resultados obtidos suportam a existência de uma protease de L. pneumophila
evolutivamente relacionada com as retropepsinas não apenas em termos de
homologia sequência-estrutura, mas também pelas suas características bioquímicas.
Esta informação é extremamente importante por duas razões: primeiro, em conjunto
com a protease aspártica de Rickettsia, constituem uma forte evidência de uma nova
família de proteases aspárticas conservadas em procariotas relacionadas com as
retropepsinas. Com isto é possível uma re-definição das teorias evolutivas no que toca
a pepsinas e retropepsinas, com a apresentação de um novo ponto de vista onde estas
sequências de procariotas representam uma forma mais ancestral das retropepsinas;
em segundo lugar, a descoberta de uma protease aspártica em L. pneumophila tal
como em outros organismos patogénicos levanta a possibilidade de encontrar novas
vias de patogenecidade e consequentemente a descoberta de novos alvos
terapêuticos para estas infeções resistentes, como alternativa ao tratamento por
antibióticos convencionais. Dissertação de mestrado em Bioquímica apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
