Autor(es):
Gamboa, Sandra Cristina de Oliveira Pinto 
Data: 2011
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10316/24594
Origem: Estudo Geral - Universidade de Coimbra
Assunto(s): Puro sangue lusitano; Antioxidantes; Égua Caballus; Sorraia; integridade cromatina (ADN)
Descrição
As raças autóctones portuguesas de equinos estão representadas pelos Puro Sangue
Lusitano (PSL), Garrano e Sorraia, sendo o PSL a que assume maior expressão. O Sorraia
corresponde a um tipo equino com elevados níveis de consanguinidade que se encontra
classificado como mantido de forma crítica. Para PSL e Sorraia, falta definir o padrão
espermático e a capacidade dos seus espermatozóides (SPZ) suportarem as tecnologias
de conservação ex situ. Além disto, os equinos são uma espécie de reprodução sazonal
de dias longos não se sabendo, à nossa latitude, como varia a qualidade espermática ao
longo do ano. Em produção animal, a predição do potencial de fertilidade do macho é
importante contudo, em equinos, os exames tradicionais de avaliação da qualidade do
esperma falham em detetar casos de subfertilidade e/ou infertilidade. Assim,
constituíram objectivos deste trabalho avaliar: parâmetros do esperma, a sua capacidade
para refrigeração e a fertilidade, em PSL e Sorraia; variações na qualidade devidas à
sazão; e a aplicabilidade de outros exames como complemento ao espermograma
sumário em garanhões. Para os PSL, utilizaram-se duas estratégias: colheita
única/múltiplos garanhões (n=152) e múltiplas colheitas (n=371)/garanhão (n=9). Estas
últimas foram comparadas com 113 ejaculados obtidos de 4 Sorraias. A sazonalidade foi
avaliada sobre 589 ejaculados obtidos nos diferentes meses do ano, de 12 garanhões com
diferentes índices reprodutivos, e analisados de acordo com 4 períodos: Setembro-
Dezembro, Janeiro-Março, Março-Maio e Maio-Julho. Espermas obtidos de garanhões
férteis e in(sub)férteis (n=53) permitiram estudar a presença, nos SPZ, de proteínas
relacionadas com a hipótese SNARE de fusão de membranas, a ubiquitinação (n=29) à
superfície dos SPZ, a funcionalidade das mitocôndrias (JC-1, n=210), a qualidade do ADN
nuclear (TUNEL, n=165), a estabilidade (M540, n=77), a funcionalidade (HOS, n=94) e a
integridade (eosina-nigrosina, n=309 e IP/SYBR 14, n=207) da membrana celular e do
acrossoma (PSA-FITC, n=239) e a oxidação (C11BODIPY e TBARS, n=232) dos fosfolípidos
de membrana. A oxidação lipídica foi também avaliada no plasma seminal (TBARSPS) e
relacionada com os parâmetros referidos assim como com a actividade antioxidante
total não-enzimática (TEAC) no PS e nos SPZ e com a integridade do ADN, avaliada, neste
caso, pelo teste de dispersão da cromatina (SCDT), em PSL e Sorraia. No PSL, a
mobilidade, morfologia e pH após colheita diferiram significativamente (P<0,05) entre
“colheita única/múltiplos garanhões” e “múltiplas colheitas/garanhão” sem que se
tenham observado efeitos da idade sobre os parâmetros avaliados. Contrariamente ao
cavalo do Sorraia, que apresenta valores marginais e baixos índices reprodutivos, no
PSL, os parâmetros do esperma são similares aos descritos para a generalidade das outras
raças equinas. Para as duas raças autóctones foi notório o efeito do garanhão (P<0,05),
enquanto fator individual de variação, sobre os parâmetros do esperma. Para a nossa
latitude, observou-se a influência da sazão na modulação dos parâmetros seminais
(P<0,05) observando-se, entre Março-Maio, superior qualidade espermática e entre
Setembro-Dezembro, os valores de qualidade seminal mais baixos. A análise
imunocitoquímica revelou a presença das proteínas sintaxina, VAMP, sinaptotagmina,Rab3a e NSF na região acrossómica dos SPZ assim como a presença de caveolina-1,
proteína envolvida na organização de lipid rafts. Os garanhões in(sub)férteis
apresentaram, nos seus ejaculados, uma percentagem de SPZ marcados para SNAREs e
caveolina-1 significativamente inferior (P<0,001) ao observado nos animais de
fertilidade comprovada. Um problema associado ao macho foi confirmado quando as
éguas que tinham ficado vazias após inseminações com sémen de um macho com
espermograma normal, foram beneficiadas com sucesso por um macho de fertilidade
comprovada. A marcação da NSF, sintaxina e caveolina-1 parece útil na predição do
potencial de fertilidade do garanhão. A utilização de vários marcadores da qualidade
dos SPZ evidenciou também diferenças significativas nos ejaculados de animais férteis e
in(sub)férteis, confirmando-se a melhor qualidade seminal durante a estação de
reprodução, apesar da diversidade de populações espermáticas presentes em cada
ejaculado. No conjunto das observações, os parâmetros PMS, vitalidade, morfologia, AI e
integridade/estabilidade do ADN são modulados pelos parâmetros funcionais avaliados,
excepto o teste HOST, contudo este revelou medir propriedades diferentes das dos
métodos de exclusão de corantes. Os TBARS parecem situar-se dentro de níveis
fisiológicos excepto no PS da raça Sorraia, uma vez que se observou um elevado nível
de peroxidação lipídica coexistente com uma elevada atividade antioxidante não
enzimática assim como com uma elevada percentagem de células com danos no ADN,
conforme revelado pelo teste SCD. Os resultados sugerem alguma disfunção nos SPZ (ou
na espermatogénese) desta raça, para além da observável ao nível morfológico e
sugerem que a produção de ATP, nos SPZ, assente sobre a via glicolítica. A introdução
dos testes HOS e SCDT na rotina laboratorial parece-nos útil na medida em que não
necessitam de equipamento sofisticado e podem ser aplicados em condições de campo.
Além disto, a marcação dos acrossomas e da superfície celular com marcadores
moleculares pode constitur uma ferramenta útil na avaliação de casos de infertilidade
idiopática em garanhões. Os resultados realçam, ainda, a importância do conhecimento
do padrão espermático não só da raça mas do indíviduo em si mesmo de forma a
maximizarem-se os índices reprodutivos. A interpretação de espermogramas efectuados
na contra-estação deverá ser feita à luz dos valores próprios dos parâmetros
espermáticos nesta altura do ano. Portuguese horse breeds are represented by Puro Sangue Lusitano (PSL), Garrano and
Sorraia. The PSL is the major national breed of horses and Sorraia horse is a closed and
endangered breed. The seminal characteristics and the possibility of conserving their
semen for future use are not well known. Furthermore, equines are long-day seasonal
breeders and no data exist on seasonal variation in semen quality in horses for our
latitude. In animal husbandry, prediction of fertility potential is important but, in
stallions traditional semen evaluation fails to detect cases of sub-fertility or even
infertility. The aim of this study was to evaluate: semen parameters, fertility and the
aptness to sperm preservation in PSL and Sorraia stallions; seasonal variations in sperm
quality; and the usefulness of other methods to assess sperm traits in order to
complement the traditional spermiogram. For PSL, two strategies were used: a single
collection by multiple stallions (n=152) and multiple collections (n=371) obtained from
a limited number of stallions (n=9). These latter samples were compared with 113
ejaculates obtained from 4 Sorraia horses. The percentage of motile spermatozoa (PMS)
was assessed after collection (AC), after semen dilution and after 24h of cool-storage.
Seasonal variations in sperm quality were monitored in semen samples (n=589)
collected from late September to July, from 12 stallions, and analyzed according to four
seasonal periods: September-December, January-March, March-May, and May-July.
Semen samples (n=53) obtained from stallions with varying fertility were also used to
study the presence of proteins implicated in the "SNARE hypothesis" for membrane
fusion as well as sperm ubiquitination (n=29), mitochondrial function (JC-1, n=210),
nDNA (TUNEL, n=165) and acrosomal integrity (PSA-FITC, n=239) and plasmalema
stability (M540, n=77), integrity (eosin-nigrosin, n=309 and IP/SYBR14 stain, n=207) and
functionality (HOS test, n=94). Lipid peroxidation was also analyzed using the TBARS
assay, in both seminal plasma and SPZ fractions (n=232), and related with the other
seminal parameters as well as with total non-enzymatic antioxidant activity (TEAC,
n=89) and nDNA integrity evaluated, in this case, by the SCD test (n=30), in PSL and
Sorraia stallions. In PSL, mean values obtained for PMS, morphology and semen pH
observed after semen collection differ significantly (P<0.05) between single
collection/multiple stallions and multiple collections/limited stallions, and no age
related effects were detected. Semen quality in PSL is similar to that of related breeds,
while Sorraia stallions had very poor semen quality. Additionally, significant
differences (P<0.05) were observed between individual stallions and between ejaculates
within stallions. Clear seasonal-based differences (P<0.05) were observed, with poor
semen quality in winter and a noticeable improvement in sperm quality with increasing
photoperiod. Better semen quality was observed between late March and May.
Immunocytochemical analysis revealed that members of different SNARE families can be
detected on the acrosome of equine sperm, notably in the acrosomal cap and equatorial
segment. These proteins include the R-SNARE syntaxin, the Q-SNARE
synaptobrevin/VAMP, the calcium sensor synaptotagmin, the GTPase Rab3a and the ATPase NSF. Also present is caveolin-1, a component of lipid rafts. Stallions with
fertility problems presented the worst quality of sperm and acrosomal membrane, and
had less sperm cells stained positively for SNAREs and caveolin-1, than sperm from
fertile donors (P<0.001). A male-related problem was confirmed when mares that had
failed to impregnate with samples from a stallion with a normal spermiogram were
successfully inseminated with sperm from a fertile donor. Furthermore NSF, syntaxin
and caveolin-1 staining seemed to be useful in predicting stallion fertility. The other
methods used to analyze sperm quality showed significant differences in semen quality
between fertile and in(sub)fertile stallions and confirmed better semen quality during
the breeding season despite an heterogeneous sperm population characterize each
ejaculate, as revealed by the probes used. PMS, viability, morphology, AI and DNA
integrity/stability are modulated by the functional parameters evaluated except HOST.
However, HOST showed to measure different properties in sperm when compared with
stain exclusion methods. In fertile stallions, TBARS in both sperm fractions never seemed
to result in compromised sperm DNA integrity, indicating that measurements were
within physiological levels. In Sorraia stallions, despite an apparent efficient antioxidant
activity in sperm, TBARS in seminal plasma were higher and coexist with DNA damage,
as revealed by SCDT. Our results suggest some dysfunction in spermatozoa (or
spermatogenesis) of this breed, beyond the observable at morphological level and
suggest that the production of ATP, in these cells, rely on glycolysis. The introduction of
HOST and SCDT in routine sperm evaluation seems to be important since these methods
do not need sophisticate equipment and can be used in field conditions. Moreover,
acrosomal and surface staining of equine sperm with molecular markers may constitute
useful tools in predicting stallion fertility. Our results also highlight the importance of
knowledge of the standard sperm characteristics not only of the breed in use but also of
individual stallion, for adjustment of the breeding program in order to maximize
reproductive rates. Semen analysis made in the non-breeding season should be
interpreted according with values defined to this year period. Tese de Doutoramento apresentada à Faculdade de Ciências e
Tecnologia da Universidade de Coimbra
