Author(s):
Monteiro, João Pedro Santos Prata 
Date: 2013
Persistent ID: http://hdl.handle.net/10316/21534
Origin: Estudo Geral - Universidade de Coimbra
Subject(s): Membrana mitocondrial; Lípidos
Document details
A lipidomic approach to hepatic mitochondrial function and toxicology : role of...
Description
There is considerable evidence that the lipid composition of cell and intracellular membranes, including those of mitochondria, is susceptible of being modulated by diet. It is also well known that lipids not only define membrane structure but also influence a multitude of signaling processes. Mitochondrial membrane lipids have been shown to play a critical role in physiological processes as diverse as protein biogenesis, energy production, membrane fusion and apoptosis. On the other hand, lipid-protein interplay assumes high importance in the mitochondrial inner membrane, which is highly vulnerable to membrane-active chemical agents. Although these findings have been extensively reported in literature, only a few studies are available specifically addressing diet potential to modulate the pharmacological/toxicological action of membrane-active drugs at the mitochondrial level. The experimental work in this thesis is divided into three main parts. In the first part, biophysical studies were carried out to unveil the membrane-mediated molecular mechanisms underlying the mitochondrial activity of three lipophilic compounds (FCCP, menadione and nimesulide). All three drugs showed to disturb membrane physical properties, although displaying dissimilar profiles of action. FCCP and menadione promoted the formation of different lipid domains in a mixed lipid system (DPPE:TOCL at 7:3 molar ratio) and favored inverted hexagonal (HII) lipid arrangements in a mitochondrial membrane mimicking model (DOPC:DOPE:TOCL, at 1:1:1 molar ratio, in the presence of Ca2+). Despite disturbing membrane order similarly to the other two drugs, nimesulide was not efficient in promoting lateral lipid segregation and, unlike the others, stabilized the lamellar arrangement in detriment of the HII structure in the ternary lipid system. Therefore, these results indicated that the physico-chemical properties of drug molecules determine, as expected, the nature and severity of their effects on membrane structure and dynamics, and provided relevant information for understanding the effects exerted by the aforementioned drugs at the mitochondrial level. In the second part of the work, a suitable protocol inducing consistent and relevant changes in the lipid composition of rat liver mitochondria was established. A diet containing 20% rapeseed oil was selected for this purpose, and was administered over a 33 day period. In parallel with an exhaustive characterization of the lipid and protein composition of mitochondrial membranes from rats fed this diet as compared to a control group of rats fed a normal (calorically adjusted) diet, the mitochondrial alterations in terms of respiration, transmembrane electric potential and induction of the permeability transition were investigated, over several time-points (11, 22 and 33 days). The diet containing 20% rapeseed oil was shown to induce changes in the mitochondrial membrane lipid composition regarding the relative proportions of phospholipid classes (an increase in the PC/PE ratio and a decrease in cardiolipin content) and in the lipid fatty acid composition (incorporation of fatty acids from the diet and a decrease in the saturated/unsaturated ratio). Mitochondrial protein content remained mostly unchanged. The diet induced changes in respiratory parameters (inhibition of state 3 and uncoupled respiration, decrease of the respiratory control and ADP/O ratios and stimulation of state 4 respiration), reduced the transmembrane electric potential (WΨ), rendered mitochondria more susceptible to Ca2+-induced mitochondrial permeability transition, and reduced hydroperoxide generation at complex I. At the final time-point (33 days), the action of the compounds whose membrane physical interactions were studied in the precedent section was also investigated on hepatic mitochondrial fractions isolated from both modified diet and control diet-fed rats. Mitochondria from rats fed the rapeseed oil-containing diet were less affected by the action of the mitochondria-active drugs FCCP, menadione and nimesulide, namely in terms of meddling with respiratory parameters and WΨ, but were more susceptible to MPT induction in the presence of nimesulide. The third part of the work regarded the influence of lipid composition on membrane binding and conformational behaviour of a typical mitochondrial protein (cytochrome c), using different membrane models, whose lipid composition was manipulated in order to reflect diet-induced changes in mitochondria lipid composition in vivo. The increase of PC/PE ratio as well as the decrease of the saturated/unsaturated fatty acid ratio, both simulating the major alterations induced by the modified diet in mitochondria membrane lipid composition in vivo, promoted a decrease of cyt c membrane binding and conformational changes upon the binding. Extrapolating these findings to other proteins, one can anticipate that diet-induced changes in mitochondrial membrane lipid composition may modulate protein binding and conformational dynamics, with expectable consequences in physiology. Taken together, these results unequivocally show that diet can modulate mitochondria membrane lipid composition, thus influencing determinant physiological processes assured by those organelles. It was also shown that drug activity at the mitochondrial level may be modulated by the diet, opening new paths for research in the context of dietary interventions with therapeutic purposes or as chemiotherapy co-adjuvants in the treatment of a wide range of diseases. Tem sido amplamente demonstrado que a composição lipídica das membranas celulares e intracelulares, incluindo as mitocondriais, é passível de ser regulada pela dieta. Também é hoje plenamente aceite que os lípidos não são meros componentes estruturais das membranas, mas estão envolvidos em inúmeros processos de sinalização. Os lípidos constituintes da membrana mitocondrial desempenham um papel fundamental em processos fisiológicos tão diversos como a biogénese de proteínas, produção de energia, fusão membranar e apoptose. Por outro lado, as interacções intermoleculares entre lípidos e proteínas assumem particular relevo ao nível da membrana mitocondrial interna, a qual é particularmente vulnerável à acção de agentes químicos que interferem com as propriedades físicas da membrana. Apesar de todos estes aspectos serem frequentemente debatidos na literatura, são escassos os estudos que investigam a regulação através da dieta da acção farmacológica/toxicológica exercida na mitocôndria por compostos com actividade membranar. O trabalho experimental a que se reporta a presente dissertação pode ser dividido em três partes. Na primeira, estudos biofísicos foram conduzidos com o intuito de esclarecer os mecanismos moleculares mediados pela membrana, subjacentes à actividade mitocondrial de três compostos lipofílicos (FCCP, menadiona e nimesulide). Os três compostos revelaram a capacidade de perturbar as propriedades físicas de membranas-modelo, embora apresentando diferentes perfis de acção. FCCP e menadiona promoveram uma separação lateral de fases numa mistura ideal de lípidos (DPPE:TOCL, na razão molar de 7:3) e favoreceram a transição para a fase hexagonal invertida (HII) num modelo membranar que simulava a composição lipídica da membrana mitocondrial (DOPC:DOPE: TOCL, nas proporções de 1:1:1, na presença de Ca2+). O fármaco nimesulide, ao contrário dos outros dois compostos, não induziu segregação dos componentes da mistura lipídica binária e estabilizou a fase lamelar em detrimento da HII, na mistura ternária. Estes resultados, além de terem mostrado que compostos com propriedades físico-químicas moleculares diferentes produzem, como seria de esperar, efeitos distintos na estrutura e dinâmica membranares, forneceram informação relevante à compreensão dos mecanismos moleculares de acção dos compostos acima mencionados na mitocôndria. Na segunda parte do trabalho, foi estabelecido um protocolo capaz de induzir alterações consistentes e significativas da composição lipídica membranar de mitocôndrias de fígado de rato. Para esse efeito, foi selecionada uma dieta contendo 20% de óleo de colza, administrada aos ratos ao longo de um período de 33 dias. Em paralelo com uma caracterização detalhada da composição lipídica e proteica das membranas mitocondriais de ratos alimentados com esta dieta, comparativamente a um grupo controlo de animais com uma dieta comum (ajustada caloricamente), foram investigadas as alterações ao nível da mitocôndria em termos de respiração, potencial eléctrico transmembranar e indução da permeabilidade transitória, a diferentes intervalos de tempo (11, 22 e 33 dias). A dieta contendo 20% de óleo de colza induziu alterações na composição lipídica da membrana mitocondrial com respeito às proporções relativas das classes de fosfolípidos (um aumento da razão PC/PE e um decréscimo da cardiolipina) e à composição em ácidos gordos (incorporação de ácidos gordos da dieta e um decréscimo da razão entre ácidos gordos saturados e insaturados). O conteúdo mitocondrial em proteínas permaneceu praticamente inalterado. Esta dieta induziu alterações nos parâmetros respiratórios (inibição do estado respiratório 3 e da respiração dissociada da fosforilação, decréscimo do índice de controlo respiratório e da razão ADP/O e estimulação do estado respiratório 4), reduziu o potencial eléctrico transmembranar (WΨ), tornou as mitocôndrias mais susceptíveis à permeabilidade transitória mitocondrial induzida por Ca2+ e diminuiu a geração de hidroperóxido ao nível do complexo I. No último tempo experimental (33 dias), a acção dos compostos, cujas interacções físicas com membranas-modelo tinham sido estudadas na secção precedente, foi avaliada em fracções mitocondriais hepáticas isoladas de ambos os grupos, ratos nutridos com a dieta modificada e com a dieta controlo. As mitocôndrias de ratos alimentados com a dieta contendo o óleo de colza foram menos afectadas pela acção dos compostos FCCP, menadiona e nimesulide, em termos de parâmetros respiratórios e WΨ, mas mostraram ser mais susceptíveis à indução de permeabilidade transitória mitocondrial na presença de nimesulide. A terceira parte do trabalho foi consagrada ao estudo da influência da composição lipídica na ligação à membrana e no comportamento conformacional de uma proteína mitocondrial típica (citocromo c), usando diferentes modelos membranares, cuja composição lipídica foi manipulada no sentido de reflectir as alterações induzidas pela dieta modificada na composição lipídica mitocondrial, in vivo. Um aumento da razão PC/PE, bem como uma diminuição da razão entre ácidos gordos saturados e insaturados, reflectindo as principais alterações induzidas pela dieta modificada na composição lipídica das membranas mitocondriais in vivo, promoveram uma diminuição na ligação do citocromo c às membranas bem como diferenças conformacionais após essa ligação. Extrapolando estes resultados para outras proteínas, pode suspeitar-se que modificações induzidas pela dieta na composição lipídica da membrana mitocondrial possam afectar a ligação de proteínas à membrana bem como a sua dinâmica conformacional, com previsíveis consequências fisiológicas. No seu conjunto, estes resultados mostraram inequivocamente que a dieta pode regular a composição lipídica membranar da mitocôndria, influenciando assim importantes processos fisiológicos assegurados por este organelo. Também ficou demonstrado que a actividade de compostos ao nível mitocondrial pode ser influenciada pela dieta, abrindo novos caminhos de pesquisa no contexto de intervenções nutricionais com propósitos terapêuticos ou como coadjuvantes de fármacos para um largo espectro de doenças. Tese de doutoramento em Biociências, no ramo de especialização em Toxicologia, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra This thesis was supported by a Ph.D. fellowship from the Portuguese FCT (SFRH/BD/37626/2007)
There is considerable evidence that the lipid composition of cell and intracellular membranes, including those of mitochondria, is susceptible of being modulated by diet. It is also well known that lipids not only define membrane structure but also influence a multitude of signaling processes. Mitochondrial membrane lipids have been shown to play a critical role in physiological processes as diverse as protein biogenesis, energy production, membrane fusion and apoptosis. On the other hand, lipid-protein interplay assumes high importance in the mitochondrial inner membrane, which is highly vulnerable to membrane-active chemical agents. Although these findings have been extensively reported in literature, only a few studies are available specifically addressing diet potential to modulate the pharmacological/toxicological action of membrane-active drugs at the mitochondrial level. The experimental work in this thesis is divided into three main parts. In the first part, biophysical studies were carried out to unveil the membrane-mediated molecular mechanisms underlying the mitochondrial activity of three lipophilic compounds (FCCP, menadione and nimesulide). All three drugs showed to disturb membrane physical properties, although displaying dissimilar profiles of action. FCCP and menadione promoted the formation of different lipid domains in a mixed lipid system (DPPE:TOCL at 7:3 molar ratio) and favored inverted hexagonal (HII) lipid arrangements in a mitochondrial membrane mimicking model (DOPC:DOPE:TOCL, at 1:1:1 molar ratio, in the presence of Ca2+). Despite disturbing membrane order similarly to the other two drugs, nimesulide was not efficient in promoting lateral lipid segregation and, unlike the others, stabilized the lamellar arrangement in detriment of the HII structure in the ternary lipid system. Therefore, these results indicated that the physico-chemical properties of drug molecules determine, as expected, the nature and severity of their effects on membrane structure and dynamics, and provided relevant information for understanding the effects exerted by the aforementioned drugs at the mitochondrial level. In the second part of the work, a suitable protocol inducing consistent and relevant changes in the lipid composition of rat liver mitochondria was established. A diet containing 20% rapeseed oil was selected for this purpose, and was administered over a 33 day period. In parallel with an exhaustive characterization of the lipid and protein composition of mitochondrial membranes from rats fed this diet as compared to a control group of rats fed a normal (calorically adjusted) diet, the mitochondrial alterations in terms of respiration, transmembrane electric potential and induction of the permeability transition were investigated, over several time-points (11, 22 and 33 days). The diet containing 20% rapeseed oil was shown to induce changes in the mitochondrial membrane lipid composition regarding the relative proportions of phospholipid classes (an increase in the PC/PE ratio and a decrease in cardiolipin content) and in the lipid fatty acid composition (incorporation of fatty acids from the diet and a decrease in the saturated/unsaturated ratio). Mitochondrial protein content remained mostly unchanged. The diet induced changes in respiratory parameters (inhibition of state 3 and uncoupled respiration, decrease of the respiratory control and ADP/O ratios and stimulation of state 4 respiration), reduced the transmembrane electric potential (WΨ), rendered mitochondria more susceptible to Ca2+-induced mitochondrial permeability transition, and reduced hydroperoxide generation at complex I. At the final time-point (33 days), the action of the compounds whose membrane physical interactions were studied in the precedent section was also investigated on hepatic mitochondrial fractions isolated from both modified diet and control diet-fed rats. Mitochondria from rats fed the rapeseed oil-containing diet were less affected by the action of the mitochondria-active drugs FCCP, menadione and nimesulide, namely in terms of meddling with respiratory parameters and WΨ, but were more susceptible to MPT induction in the presence of nimesulide. The third part of the work regarded the influence of lipid composition on membrane binding and conformational behaviour of a typical mitochondrial protein (cytochrome c), using different membrane models, whose lipid composition was manipulated in order to reflect diet-induced changes in mitochondria lipid composition in vivo. The increase of PC/PE ratio as well as the decrease of the saturated/unsaturated fatty acid ratio, both simulating the major alterations induced by the modified diet in mitochondria membrane lipid composition in vivo, promoted a decrease of cyt c membrane binding and conformational changes upon the binding. Extrapolating these findings to other proteins, one can anticipate that diet-induced changes in mitochondrial membrane lipid composition may modulate protein binding and conformational dynamics, with expectable consequences in physiology. Taken together, these results unequivocally show that diet can modulate mitochondria membrane lipid composition, thus influencing determinant physiological processes assured by those organelles. It was also shown that drug activity at the mitochondrial level may be modulated by the diet, opening new paths for research in the context of dietary interventions with therapeutic purposes or as chemiotherapy co-adjuvants in the treatment of a wide range of diseases. Tem sido amplamente demonstrado que a composição lipídica das membranas celulares e intracelulares, incluindo as mitocondriais, é passível de ser regulada pela dieta. Também é hoje plenamente aceite que os lípidos não são meros componentes estruturais das membranas, mas estão envolvidos em inúmeros processos de sinalização. Os lípidos constituintes da membrana mitocondrial desempenham um papel fundamental em processos fisiológicos tão diversos como a biogénese de proteínas, produção de energia, fusão membranar e apoptose. Por outro lado, as interacções intermoleculares entre lípidos e proteínas assumem particular relevo ao nível da membrana mitocondrial interna, a qual é particularmente vulnerável à acção de agentes químicos que interferem com as propriedades físicas da membrana. Apesar de todos estes aspectos serem frequentemente debatidos na literatura, são escassos os estudos que investigam a regulação através da dieta da acção farmacológica/toxicológica exercida na mitocôndria por compostos com actividade membranar. O trabalho experimental a que se reporta a presente dissertação pode ser dividido em três partes. Na primeira, estudos biofísicos foram conduzidos com o intuito de esclarecer os mecanismos moleculares mediados pela membrana, subjacentes à actividade mitocondrial de três compostos lipofílicos (FCCP, menadiona e nimesulide). Os três compostos revelaram a capacidade de perturbar as propriedades físicas de membranas-modelo, embora apresentando diferentes perfis de acção. FCCP e menadiona promoveram uma separação lateral de fases numa mistura ideal de lípidos (DPPE:TOCL, na razão molar de 7:3) e favoreceram a transição para a fase hexagonal invertida (HII) num modelo membranar que simulava a composição lipídica da membrana mitocondrial (DOPC:DOPE: TOCL, nas proporções de 1:1:1, na presença de Ca2+). O fármaco nimesulide, ao contrário dos outros dois compostos, não induziu segregação dos componentes da mistura lipídica binária e estabilizou a fase lamelar em detrimento da HII, na mistura ternária. Estes resultados, além de terem mostrado que compostos com propriedades físico-químicas moleculares diferentes produzem, como seria de esperar, efeitos distintos na estrutura e dinâmica membranares, forneceram informação relevante à compreensão dos mecanismos moleculares de acção dos compostos acima mencionados na mitocôndria. Na segunda parte do trabalho, foi estabelecido um protocolo capaz de induzir alterações consistentes e significativas da composição lipídica membranar de mitocôndrias de fígado de rato. Para esse efeito, foi selecionada uma dieta contendo 20% de óleo de colza, administrada aos ratos ao longo de um período de 33 dias. Em paralelo com uma caracterização detalhada da composição lipídica e proteica das membranas mitocondriais de ratos alimentados com esta dieta, comparativamente a um grupo controlo de animais com uma dieta comum (ajustada caloricamente), foram investigadas as alterações ao nível da mitocôndria em termos de respiração, potencial eléctrico transmembranar e indução da permeabilidade transitória, a diferentes intervalos de tempo (11, 22 e 33 dias). A dieta contendo 20% de óleo de colza induziu alterações na composição lipídica da membrana mitocondrial com respeito às proporções relativas das classes de fosfolípidos (um aumento da razão PC/PE e um decréscimo da cardiolipina) e à composição em ácidos gordos (incorporação de ácidos gordos da dieta e um decréscimo da razão entre ácidos gordos saturados e insaturados). O conteúdo mitocondrial em proteínas permaneceu praticamente inalterado. Esta dieta induziu alterações nos parâmetros respiratórios (inibição do estado respiratório 3 e da respiração dissociada da fosforilação, decréscimo do índice de controlo respiratório e da razão ADP/O e estimulação do estado respiratório 4), reduziu o potencial eléctrico transmembranar (WΨ), tornou as mitocôndrias mais susceptíveis à permeabilidade transitória mitocondrial induzida por Ca2+ e diminuiu a geração de hidroperóxido ao nível do complexo I. No último tempo experimental (33 dias), a acção dos compostos, cujas interacções físicas com membranas-modelo tinham sido estudadas na secção precedente, foi avaliada em fracções mitocondriais hepáticas isoladas de ambos os grupos, ratos nutridos com a dieta modificada e com a dieta controlo. As mitocôndrias de ratos alimentados com a dieta contendo o óleo de colza foram menos afectadas pela acção dos compostos FCCP, menadiona e nimesulide, em termos de parâmetros respiratórios e WΨ, mas mostraram ser mais susceptíveis à indução de permeabilidade transitória mitocondrial na presença de nimesulide. A terceira parte do trabalho foi consagrada ao estudo da influência da composição lipídica na ligação à membrana e no comportamento conformacional de uma proteína mitocondrial típica (citocromo c), usando diferentes modelos membranares, cuja composição lipídica foi manipulada no sentido de reflectir as alterações induzidas pela dieta modificada na composição lipídica mitocondrial, in vivo. Um aumento da razão PC/PE, bem como uma diminuição da razão entre ácidos gordos saturados e insaturados, reflectindo as principais alterações induzidas pela dieta modificada na composição lipídica das membranas mitocondriais in vivo, promoveram uma diminuição na ligação do citocromo c às membranas bem como diferenças conformacionais após essa ligação. Extrapolando estes resultados para outras proteínas, pode suspeitar-se que modificações induzidas pela dieta na composição lipídica da membrana mitocondrial possam afectar a ligação de proteínas à membrana bem como a sua dinâmica conformacional, com previsíveis consequências fisiológicas. No seu conjunto, estes resultados mostraram inequivocamente que a dieta pode regular a composição lipídica membranar da mitocôndria, influenciando assim importantes processos fisiológicos assegurados por este organelo. Também ficou demonstrado que a actividade de compostos ao nível mitocondrial pode ser influenciada pela dieta, abrindo novos caminhos de pesquisa no contexto de intervenções nutricionais com propósitos terapêuticos ou como coadjuvantes de fármacos para um largo espectro de doenças. Tese de doutoramento em Biociências, no ramo de especialização em Toxicologia, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra This thesis was supported by a Ph.D. fellowship from the Portuguese FCT (SFRH/BD/37626/2007)
Document Type
Doctoral Thesis
Language English
Advisor(s) Jurado, Maria Amália da Silva; Oliveira, Paulo Jorge
Language English
Advisor(s) Jurado, Maria Amália da Silva; Oliveira, Paulo Jorge
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