Autor(es):
Ramos, Teresa da Conceição Lopes 
Data: 2011
Identificador Persistente: http://hdl.handle.net/10316/20335
Origem: Estudo Geral - Universidade de Coimbra
Assunto(s): Medula óssea; Transplante de células estaminais hematopoiéticas
Descrição
Umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation (UCB-HSCT) is an increasing
area both clinical and translational investigation. The main hurdle of this approach is a
delayed engraftment (or even a graft failure) that accounts the most of the transplantrelated
mortality. To gain insight on the factors that may influence UCB engraftment is
important to implement the clinical procedure. The interaction of hematopoietic
progenitors with the stroma is the key process in this setting. Nevertheless, the
establishment of a good in vitro model to evaluate three-dimensionally (3D) system part of
the complex BM microenvironment are not well established.
In this study we have tried to develop an artificial BM niche by using a scaffold of Conduit-
TCP (3D) together with human marrow mesenchymal stem cells (MSC). MSC were
differentiated to stromal cells using the technology of classic long term bone marrow
cultures (LTBMC). For this purpose, CD34+ cells from UCB were cultured for 5 weeks in
this 3D-BM niche construct (3D system), demonstrating the capacity of this construct to
support the maintenance of immature progenitors in culture, besides the differences in
colony formation between this 3D system and the conventional two dimensional cultures
(2D system) were not statistically significant.
To complement the in vitro studies, we developed an in vivo experimental model to
evaluate the engraftment capacity of this human-BM niche construct by implanting them
subcutaneously in NOD/SCID mice after 4 weeks or 5 weeks of in vitro culture, showing
better engraftment of the former group both at 3 and 6 weeks after transplantation of
human UCB CD34+ cells. When compared this approach to a control group where the 3DBM
niche was developed in vivo by implanting the scaffold with undifferentiated human
MSC, the former group had higher engraftment of human hematopoietic cells (CD45+) at 3
weeks postransplant on peripheral blood and 6 weeks on BM, with myeloid engraftment
(CD13+). The control group presented higher human lymphoid cells (CD19+) when CD34+
cells were transplant intravenously and lower human CD19+ cells with a predominant
human myeloid graft when the HSC were subcutaneously transplanted.
The 6 weeks after transplantation an ex vivo study was performed. Immunohistochemistry
and immunofluorescence assays demonstrated the homing and engraftment of the human
cells into the 3D-BM niche in vitro constructs that were subcutaneously implanted. In
addition, human MSC from the scaffolds contributed to form new cells in the
microenvironment, contributing also to angiogenesis. By employing enhanced cyan fluorescent protein-marked human MSC we were able to track them close to the
endosteal zone.
In summary, the 3D-BM niche constructs allowed the growth, differentiation and migration
of HSC in a 3D humanized environment effectively mimicking the natural in vivo bone
marrow environment that allows the maintenance and proliferation of hematopoietic cells
both in vivo and in vitro. This model permits the study of normal and pathological
hematopoiesis and its relationship with the stroma. O transplante de células progenitoras/estaminais hematopoiéticas do sangue do cordão
umbilical (SCU) é uma das terapias disponíveis para a clínica e uma área em expansão
na investigação. O obstáculo principal da utilização destes progenitores está associado a
uma lenta recuperação dos doentes, levando a um aumento no risco de falência do
enxerto, incrementando a incidência de mortalidade nestes doentes. Esta limitação pode
ser ultrapassada quando os factores que influenciam o sucesso do enxerto de SCU forem
conhecidos, sendo crucial o estudo das interacções que ocorrem entre as células
progenitoras e o seu ambiente (estroma).
Ainda não estão estabelecidos modelos experimentais empregando estromas a 3
dimensões (3D) que criam uma analogia ao complexo sistema que ocorre na medula
óssea (MO) para estudos in vitro, sendo crucial o seu desenvolvimento.
Neste trabalho procurou-se estabelecer um “nicho” artificial de MO usando um biomaterial
- Conduit-TCP (3D), juntamente com células precursoras mesenquimatosas humanas de
medula óssea. Estas células foram diferenciadas a estroma utilizando técnicas clássicas
de cultivo a longo prazo de medula óssea. Para atingir o objectivo do estudo as células
CD34+ de SCU foram cultivadas durante cinco semanas neste “nicho” a 3D, que
demonstrou capacidade durante o tempo de cultura de manter em estado imaturo as
células progenitoras hematopoiéticas. A produção de colónias (CFU-GM) provenientes
destes sistemas é superior à produção de colónias quando comparados com o sistema
de cultivo convencional a duas dimensões, contudo não são diferenças significativas.
Para complementar a estudos in vitro, desenvolvemos um modelo experimental in vivo de
forma a avaliar a capacidade de enxerto das células expandidas neste “nicho” artificial,
para tal implantamos subcutaneamente este biomaterial proveniente de cultivos com 4 e
5 semanas em murganhos NOD/SCID (animais imunossuprimidos). Na terceira e sexta
semana após o xenotransplante o grupo onde foram implantados os biomateriais com
menos tempo de cultivo (4 semanas), apresentavam maior recuperação hematopoiética
de células humanas (CD45+). Quando se compara com o grupo standard em que o
“nicho” foi construído in vivo, verificamos um maior nível de células humanas CD45+ no
sangue periférico nas três semanas pós-transplante e em medula óssea na sexta semana
pós-transplante, com regeneração medular mielóide (CD13+) para o grupo experimental.
No grupo standard as células CD34+ foram transplantadas 7 semanas após indução in vivo das células mesenquimatosas a estroma em que se verificou maior enxerto de
células CD19+ quando as células CD34+ foram transplantadas por via intravenosa,
contudo quando subcutaneamente transplantadas esta linhagem linfóide diminuía.
Quando finalizadas as 6 semanas foram realizados estudos ex vivo por histologia,
imunohistoquímica e imunofluorescência ao biomaterial subcutaneamente implantado e
aos fémur dos animais dos diferentes grupos.
No caso dos grupos em que foram transplantados com o “nicho”
(biomaterial+estroma+célulasCD34+) construído in vitro as células progenitoras
hematopoieticas conseguiram migrar (homing) deste sistema para a medula óssea dos
animais.
Verificou-se regeneração de novo tecido no ConduitTMTCP em que as células
mesenquimatosas humanas não só contribuíram para a formação do estroma nestes
implantes como também na angiogénese. Um dado muito interessante foi a confirmação
de que estas células similarmente as células humanas hematopoiéticas também foram
capazes de migrar para a medula óssea murina encontrando-se principalmente na zona
endosteal
Em resumo, o nicho medular construído in vitro num sistema a 3D permitiu o crescimento,
diferenciação e migração das células progenitoras hematopoieticas criando uma analogia
ao ambiente da medula óssea humana, o que permitiu a manutenção e proliferação de
células hematopoiéticas in vivo e in vitro. Este modelo permite o estudo da hematopoiese
normal e patológica e sua relação com o estroma. Dissertação de mestrado em Medicina (Patologia Experimental), apresentado à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
Tipo de Documento
Dissertação de Mestrado
Idioma
Português
Orientador(es)
Sánchez-Guijó, Fermín Martín; Cabrita, António Manuel Silvério
